胃宁颗粒治疗胃癌前病变实验研究

作者：邓鑫    作者单位：530011 南宁，广西中医学院附属瑞康医院；2．广东深圳75620部队80分队卫生所     【摘要】  目的 探讨胃宁颗粒对胃癌前病变的治疗作用及可能机制。方法 60只大鼠随机分成空白组、模型组、维甲酸组、胃宁颗粒低剂量组、胃宁颗粒中剂量组、胃宁颗粒高剂量组。观察治疗前后各组大鼠一般情况、胃黏膜病理组织学、端粒酶活性、细胞增殖指数（PI）、细胞凋亡指数（AI）的变化。结果 胃宁颗粒各剂量组活动、饮食等一般情况好转，肠化生（IM）、不典型增生（ATP）、端粒酶阳性发生例数显著低于模型组（P<0.05或P<0.01）；胃宁颗粒各剂量组细胞增殖指数（PI）与模型组相比显著降低（P<0.01），凋亡指数（AI）显著增高（P<0.05）。结论 胃宁颗粒对胃癌前病变具有治疗作用，其机制可能与抑制端粒酶活性、促进癌前病变细胞凋亡抑制其增殖有关。

    【关键词】  胃癌 癌前病变 胃宁颗粒

    胃癌在全世界范围内占各类恶性肿瘤死因第2位,在中国也居第2位且未见明显下降趋势[1]。大量研究表明，胃癌的发生是一个漫长的演进过程。正常胃黏膜→浅表性胃炎→萎缩性胃炎→肠化生→异型增生→胃癌（肠型）的发病模式已经被普遍接受。在胃黏膜癌变发生发展过程中进行干预，可有效地降低胃癌的发生率。

    1  材料与方法

    1.1  实验动物

    健康雄性Wistar大鼠60只，体重80～100g，由广西医科大学实验动物中心提供。

    1.2  药品

    胃宁颗粒：广西中医学院百年乐制药厂，产品批号20050806；维甲酸胶囊：重庆华邦制药有限公司，产品批号20040607。

    1.3  仪器与试剂

    ALLEGRA 64R型低温离心机：美国贝克曼公司产品； GH802 型单人水平净化工作台；天津生物洁净设备厂产品；spectra Ⅲ型酶标仪：奥地利TECAN公司产品。端粒酶活性检测试剂盒：华美生物工程公司产品；细胞增殖检测试剂盒：武汉博士德生物工程有限公司产品；细胞凋亡检测试剂盒：武汉博士德生物工程有限公司产品； N甲N硝基亚硝基胍(MNNG)：德国FluKa产品。

    1.4  分组方法

    60只Wistar大鼠随机分成空白组、模型组、维甲酸组、胃宁颗粒低剂量组、胃宁颗粒中剂量组、胃宁颗粒高剂量组（以下简称低、中、高剂量组），每组10只。适应性喂养1周后，除空白组大鼠正常饲养，其他5组大鼠进行造模。

    1.5  造模方法

    参照陆为民[2]方法并加以改进。具体方法如下：每日自由饮用100μg/ml MNNG液（饮水瓶用油漆涂黑避光），进食含0.03％雷尼替丁的纯鼠颗粒饲料，上午用56℃ 15％盐水按10ml/kg灌胃，禁食，当天下午用40％酒精按10ml/kg灌胃。每周用钳子夹住大鼠尾部一次，使之保持激怒、争斗状态，持续30 min，上述方法连续造模24周。

    1.6  给药方法

    胃宁颗粒高、中、低剂量组，分别为等效剂量的 4∶2∶1 倍（按大鼠与人的体表面积比计算）。等效剂量计算公式：大鼠等效剂量=人日用量×0.018×5。配成水溶液，高剂量组生药含量2.088g/ml，中剂量组生药含量1.044g/ml，低剂量组生药含量0.522g/ml。维甲酸组：大鼠剂量按等效剂量的2 倍量计算，配成水溶液，生药含量0.0762g/ml。空白组和模型组：用0.9%生理盐水。各组均按10ml/kg 体重的体积灌胃。10周为1疗程，共治疗1个疗程。用药24 h后处死大鼠，检测相关指标。

    1.7  检测指标

    1.7.1  一般情况

    观察各组大鼠饮食、精神状态、形体、活动情况、被毛光泽度、大便及存活情况。

    1.7.2  胃黏膜的大体病理改变

    将胃沿大弯侧打开，肉眼观察胃黏膜的色泽、皱襞的改变，胃壁厚薄、胃黏膜表面增生结节、糜烂和溃疡等情况。

    1.7.3  胃黏膜病理组织学改变

    观察各组胃黏膜病理组织学改变，计数各组浅表性胃炎（CSG）、萎缩性胃炎（CAG）、肠化生（IM）、不典型增生（ATP）发生例数。

    1.7.4  端粒酶活性的测定

    采用单管法一步完成端粒重复序列扩增过程。胃黏膜组织，离心、洗涤后加入50μl的裂解液，经冰浴、离心后取上清2μl加入到TRAP反应中，另加45μl反应混合物，液体石腊封口，置25℃水浴30min后，94℃ 5min灭活端粒酶，然后行PCR循环，PCR循环结束后，进行杂交反应，洗板，二次杂交反应，洗板，加入显色液显色，最后置于酶标仪判定结果，波长450nm读取OD值，标本OD值大于阴性对照OD值的2.1倍时，判为端粒酶活性阳性。

    1.7.5  细胞增殖指数（PI）的测定

    采用PCNA法。步骤按照试剂盒要求，计数5个视野的凋亡细胞数与癌细胞总数，取其平均值，计算PI。PI＝PCNA阳性细胞数/细胞总数×100％。

    1.7.6  细胞凋亡指数（AI）的测定

    采用TdT介导的DNA末端原位标记染色法检测细胞凋亡。步骤按照试剂盒要求，计数5个视野的凋亡细胞数与癌细胞总数，取其平均值，计算AI。AI=TUNEL阳性细胞数/细胞总数×100％。

    1.8  统计学方法

    所有数据采用SPSS13.0进行统计分析，计数资料采用χ2检验，计量资料组间比较采用方差分析。

    2  结果

    2.1  各组大鼠一般情况的变化

    正常组始终形肥体胖，食量较多，活动灵敏，被毛光泽；模型组形体消瘦，活动减少，被毛无光泽，食量少，大便稀溏；胃宁颗粒低、中、高剂量治疗组上述表现均不同程度好转，食量和活动增加，体重上升，大便转为正常；维甲酸组大鼠食欲有所增加，但被毛欠光泽，体重有所上升，大便成形。

    2.2  各组大鼠胃黏膜的大体病理改变

    正常组胃粘膜呈粉红色，有光泽，被覆较多黏液，黏膜皱襞表面光滑，走向规则，胃壁弹性良好，未见增生结节。造模组24周时，大鼠胃壁弹力减弱，黏膜层变薄，色苍白或紫暗，皱璧变平或走向紊乱，有的黏膜表面黄染，胃窦部可见一至数个灰白色结节，有的形成息肉状或菜花状隆起，质地偏硬，大部分大鼠胃黏膜糜烂充血或有溃疡形成。胃宁颗粒低、中、高剂量组皱襞紊乱、黏膜变薄或皱襞平坦、增生结节、黏膜黄染较模型组相比显著改善（P<0.05或P<0.01），见表1。表1  各组大鼠胃黏膜大体病理改变

　　2.3  胃黏膜病理组织学改变

    模型组大鼠10例中有5例呈现中度及重度ATP，4例出现IM；胃宁颗粒中、高剂量组IM发生例数较模型组相比显著降低（P<0.05）；胃宁颗粒高剂量组ATP发生例数较模型组相比显著降低（P<0.01），见表2。

    2.4  各组大鼠端粒酶活性的变化

    在造模药物作用下,模型组大鼠有6例端粒酶被激活,胃宁颗粒治疗后胃黏膜端粒酶活性被抑制,胃宁颗粒低剂量组端粒酶阳性例数与模型组相比显著降低（P<0.05）, 胃宁颗粒中、高剂量组端粒酶阳性例数与模型组相比显著降低（P<0.01），见表3。表2  各组大鼠胃黏膜病理组织学改变表3  各组大鼠胃黏膜端粒酶活性的变化

    2.5  各组大鼠细胞增殖指数（PI）凋亡指数（AI）的变化

    模型组胃黏膜细胞增殖增强凋亡减弱；维甲酸组、胃宁颗粒低、中、高剂量组细胞增殖指数（PI）与模型组相比显著减弱（P<0.01），凋亡指数（AI）显著增高（P<0.05），见图1。

    3  讨论

    中国是胃癌的高发区，虽然城市人口胃癌的患病率有所下降，但农村人口患胃癌的人数大幅增加。同时，年轻人患胃癌的比例在升高。中药由于毒副作用较小，与化学药物相比具有一定的优势，为开发无毒或低毒的抗肿瘤药物提供了新的渠道，在防治胃癌方面发挥了积极的作用[3，4]。中医认为，胃癌是由正气不足、瘀毒内结所致[5]。胃宁颗粒由黄芪、茯苓、莪术、枸杞组成，具有健脾益气，活血祛瘀的作用，用于胃癌治疗及胃癌转移防治。现代药理表明，黄芪、莪术等药物可增强树突状细胞的抗肿瘤作用，有效地促进荷瘤宿主的免疫应答，具有显著的抑瘤作用[6，7]。我们前期研究也发现，胃宁颗粒能抑制人胃癌SGC7910细胞增殖诱导其凋亡, 能抑制人胃癌SGC7910细胞与层黏连蛋白（FN）的黏附，抑制细胞运动和侵袭, 降低人胃癌SGC7910细胞基质金属蛋白酶2（MMP2）和基质金属蛋白酶9（MMP9）的含量[8，9]。

    现代医学关于胃癌前病变的发病原因及机制尚不完全清楚，可能涉及多种因素如幽门螺旋杆菌(HP)感染、烟、酒、饥饱失常、咸食或腌制食物(含高盐、亚硝酸盐等)、烫热饮食、NSAID类药物刺激、十二指肠液反流、免疫、遗传、年龄等综合因素，这些病因的持续存在或反复作用使胃黏膜反复损伤和修复，病情趋于慢性化，先有多种基因的异常，继而出现细胞代谢的异常，再有组织形态学的异常甚至肿瘤[10，11]。近年来研究发现由正常胃黏膜细胞→癌前病变细胞→癌细胞的演变是一个多因素、多基因作用及多阶段致癌的复杂过程[12，13]。这一过程中有细胞的代谢，基因的不稳定性(如微卫星不稳、端粒酶激活)等异常改变，均可使细胞凋亡与增殖平衡失调而发生恶性转化。但在癌前病变阶段，虽然也有不同程度的上述改变，但这些都是可逆的。所以，对癌前病变进行干预治疗，阻止其发生癌变或使其逆转为正常，对降低胃癌发病率有重要意义。

    目前建立胃癌前病变模型方法主要有以下五种：(1)胃黏膜反复损伤造模方法；(2)免疫造模方法；(3)小剂量X线局部造模方法；（4）主动免疫结合胃黏膜损伤造模方法；（5）结合致癌物的综合造模方法。前四种方法操作复杂或成本高或周期长，难以推广应用。目前以结合致癌物的综合造模方法最为常用，MNNG结合胃癌前病变其他相关因素的联合攻击，不仅模拟了人的患病因素，而且缩短了造模时间，不失为一种较理想的制造胃癌前病变模型的方法。本实验在成功建立大鼠实验性胃癌前病变模型的基础上，肉眼观察了胃宁颗粒对大鼠胃黏膜形态改变的影响。模型组大部分大鼠胃黏膜糜烂充血或有溃疡形成。胃宁颗粒低、中、高剂量病变有明显改善，已基本接近正常组。病理组织学检测，正常组大鼠胃黏膜上皮细胞排列整齐完整，腺体形态规则，大小一致，细胞核位于腺体细胞基底部，固有层偶见炎性细胞浸润，黏膜肌层未见增生及向黏膜层伸入。造模大鼠于24周时(即模型成功时)，胃粘膜呈多灶性萎缩，腺体排列紊乱，基底部腺体大小差异明显，上皮细胞形态大小不一，细胞增生明显，细胞核染色加深，核浆比例增大，出现共壁现象，黏膜肌层向黏膜层延伸。模型组大鼠10例中有5例呈现中度及重度ATP，4例出现IM；维甲酸组3例呈轻度或中度ATP，有6例存在轻、中、重度的CAG；胃宁颗粒低、中、高剂量组IM、ATP发生例数显著低于模型组（P<0.05或P<0.01），说明胃宁颗粒能阻止胃黏膜癌变的发生发展。

    近年来研究发现端粒及端粒酶与恶性肿瘤形成密切相关[14]。当细胞分裂时，染色体末端端粒进行性缩短，达到一定程度，则细胞表现危象，此时端粒酶被激活，维持端粒长度，细胞获得永生（immortalization）。端粒酶是一种主要由RNA和蛋白质组成的核糖核蛋白，它有别于一般的DNA聚合酶，是一种专一的逆转录酶。端粒酶能以端粒末端加入六聚体的TTAGGG重复序列。由于端粒酶的存在，端粒长度得以维持，细胞得以持续分裂，成为永生化细胞，即恶性肿瘤细胞。目前大多数学者认为，端粒酶的激活可能是细胞永生化和恶性肿瘤发生的关键环节[15,16]。端粒酶的激活在胃黏膜癌变形成、发展中扮演重要角色，在正常胃黏膜→浅表性胃炎→萎缩性胃炎→肠化生→异型增生→胃癌过程中，端粒酶阳性表达率呈递增趋势[17,18]。因此，以端粒酶为靶点诊疗胃黏膜癌变具有重要的意义。在本实验当中，模型组在造模药物作用下,6例端粒酶被激活,胃宁颗粒治疗后胃黏膜端粒酶活性被抑制,胃宁颗粒可能通过抑制端酶活性从而治疗癌前病变。

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