塞来昔布对前列腺癌细胞株PC3中VEGFC及bcl2 mRNA表达的影响

作者：胡乃刚    作者单位：266011 山东青岛大学医学院附属市立医院泌尿外科；2. 青岛大学医学院附属医院泌尿外科     【摘要】  目的 探讨环氧化酶2(COX2)选择性抑制剂塞来昔布(celecoxib)对前列腺癌细胞株PC3 中VEGFC mRNA及bcl2 mRNA表达的影响,研究COX2抑制剂抗肿瘤的作用机制。方法 将培养的PC3细胞分为四组：试验组(分别以10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L不同浓度塞来昔布处理)和对照组，采用RTPCR的方法检测四组中VEGFC及bcl2 mRNA的表达。结果 10μmol/L塞来昔布组VEGFC/GAPDH值及bcl2/GAPDH值与对照组相比差别均无统计学意义(P＞0.05)；20μmol/L及40μmol/L塞来昔布组VEGFC/GAPDH值分别为0.370±0.063、0.263±0.062，bcl2/GAPDH值分别为0.339±0.047、0.272±0.042，两组中上述两项指标均较对照组明显下降(P均＜0.01）。结论 塞来昔布可能通过对前列腺癌细胞株PC3中VEGFC及bcl2 mRNA表达的抑制发挥其抗肿瘤作用。

    【关键词】  前列腺癌 塞来昔布 血管内皮生长因 bcl2

    研究表明，环氧化酶2（COX2）在前列腺癌组织中表达增强[1，2]。体外实验证实COX2抑制剂具有抑制前列腺癌细胞生长的作用[3,4]，但其抗肿瘤的机制尚不完全明确。本实验采用RTPCR的方法对前列腺癌细胞株PC3中的VEGFC及bcl2 mRNA进行检测，进而探讨COX2选择性抑制剂塞来昔布(celecoxib)的抗癌机制。

    1  材料与方法

    1.1  细胞株

    人雄激素非依赖性前列腺癌细胞株PC3,由青岛大学医学院病理生理教研室惠赠。

    1.2  主要试剂

    选择性COX2抑制剂塞来昔布购自普强苏州制药有限公司。RPMI 1640培养液、小牛血清均购自青岛海泰生物技术有限公司；总RNA提取试剂盒，cDNA合成试剂盒及PCR扩增试剂盒均购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

    1.3  细胞培养及实验分组

    将塞来昔布加入适量的0.01mol/L PBS(pH7.4)中配制成5.6mg/L母液，高压灭菌于4℃保存，使用时用培养液稀释成所需浓度；在含10%小牛血清的RPMI1640细胞培养基中加青霉素及链霉素各100U/ml，将PC3细胞接种于配好的培养基中，在37℃、5%CO2及95%饱和湿度条件下培养，每3～5天传代。取对数生长期的前列腺癌细胞进行实验，用质量分数0.25%的胰蛋白酶消化,加培养液制成5×105/ml细胞悬液，接种于96孔培养板，200μl/孔,待细胞贴壁后去上清，试验组分别加入含10、20、40μmol/L三种不同浓度的塞来昔布培养液,每一浓度设10个重复孔，对照组仅加入含10 %小牛血清的RPMI 1640培养液。继续培养72h后收集细胞，进行总RNA提取及RTPCR检测。

    1.4  引物的设计与合成

    采用Primer5.0软件设计相关基因引物序列。bcl2的引物序列为：上游引物5′GTG GTG GAG GAG CTC TTC AG3′，下游引物5′TCC ACA AAG GCA TCC CA G3′，产物片段长203bp；VEGFC上下游的引物序列分别为：5′AAT GTG GGG CCA ACC GAG AA3′，5′CCA ATA TGA AGG GAC ACA ACG3′，扩增长度为259bp；内对照3磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)上下游引物分别为：5′GGT GAA GGT CGG AGT CAA CGG3′，5′GGT GAT GAG TCC TTC CAC GAT3′，扩增长度为425bp。以上引物均由上海生物工程技术服务有限公司合成。

    1.5  总RNA 提取及RTPCR

    采用Trizol一步法提取总RNA。紫外分光光度计测样品A260和A280值, 琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA质量，其余-80℃保存。按逆转录试剂盒说明书操作反转录合成cDNA，产物-20℃保存。取反转录产物5μl进行PCR扩增，反应体系为50μl，包括10×Buffer 5μl，25mmol/L MgCl23μl，10mmol/L dNTP 1μl，上下游引物各2.5μl，cDNA模板5μl，Taq酶1μl，ddH2O 30μl。VEGFC的反应条件为：94℃预变性1min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸40s，共35个循环，最后72℃延伸10min；bcl2的反应条件：94℃预变性2min后，94℃45s，50℃退火40s，72℃60s，共进行35个循环，最后72℃延伸10min；GAPDH作为内参照基因与目的基因一一对应同时进行PCR反应，以达定量目的。PCR 扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳EB染色观察结果。以平均吸光度×条带面积表示总的吸光度，以此代表mRNA 的量。凝胶图像分析系统以VEGFC和bcl2基因与内参照基因（GAPDH）电泳带的吸光度比值作为VEGFC和bcl2 mRNA的表达量指标。

    1.6  统计学方法

    采用SPSS12.0统计软件进行单因素方差分析和两两比较q检验，数据均用±s表示。

    2  结果

    前列腺癌细胞PC3中VEGFC及bcl2 mRNA表达的PCR产物凝胶电泳结果见图1、2。在三个处理组中，20μmol/L、40μmol/L塞来昔布组VEGFC和bcl2mRNA表达量均降低，尤以40μmol/L组降低明显。凝胶图像分析系统分析结果经统计软件处理，对照组与各处理组中VEGFC/GAPDH及bcl2/GAPDH的值见表1、2。表明在一定浓度范围内，塞来昔布对PC3细胞株中VEGFC及bcl2 mRNA的表达有抑制作用。表1  VEGFC mRNA在PC3中的表达 表2  bcl2 mRNA在PC3中的表达

    3  讨论

    环氧化酶是前列腺素合成过程中的限速酶，有COX1、COX2和COX3三种。自上世纪90年代COX2抑制剂的抗肿瘤作用日益受到人们重视，动物实验也已证明选择性COX2抑制剂可对肿瘤产生显著治疗作用［5］。COX2抑制剂防治肿瘤的机制可能是通过抑制COX2进而抑制肿瘤细胞增殖和诱导凋亡。塞来昔布是近年来开发的新型非甾体类抗炎药,其抗肿瘤作用已有报道［6］,但其作用机制尚不完全清楚。据此，我们选择了VEGFC和bcl2作为研究对象探讨COX2抑制剂抗肿瘤的作用机制。

    肿瘤的生长、浸润和转移是血管生成依赖性的，当肿瘤＞0.4mm3时，为保证其快速增殖，必须有血管生成［7］。提示血管内皮生成因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)与恶性肿瘤的发生及生长有一定关系。VEGFC是VEGF家族成员之一，有较强的促进新生血管和淋巴管形成作用，参与病理性、生理性淋巴管和血管新生。已有实验表明，前列腺癌组织VEGFC mRNA的表达，促进了肿瘤诱导的淋巴管新生，在前列腺癌的淋巴转移中发挥了重要作用［8］。Cheng等［9］对肝癌组织中COX2 、VEGF、前列腺素( PG) 以及肿瘤微血管密度(MVD) 的状况进行了检测, 发现COX2 和VEGF 在肝细胞癌中的表达均有增高 ,且COX2 与VEGF及MVD有关(P=0.003和P=0.004)。在某些消化道肿瘤中COX2表达与VEGF呈正相关，提示COX2可能通过诱导VEGF表达上调促进肿瘤生长［10］。

    bcl2基因是从滤泡性淋巴细胞中分离出来的一种癌基因。在多种肿瘤中表达，具有抑制肿瘤细胞凋亡的作用［11］。bcl2基因的过度表达并不影响细胞增殖和加速细胞分裂，而是阻止细胞凋亡的发生，延长肿瘤细胞生存时间［12］。在对某些皮肤肿瘤的研究中发现，bcl2 的表达与COX 2 的过表达有关，COX2 可能是通过激活bcl2 发挥抗凋亡作用而促进皮肤肿瘤形成及发展。

    本实验证实了一定浓度的塞来昔布对前列腺癌细胞株PC3中VEGFC及bcl2 mRNA的表达有抑制作用，表明COX2抑制剂可能通过对前列腺癌细胞中VEGFC和bcl2基因表达的抑制来发挥其抗肿瘤作用。这为临床上治疗前列腺癌，特别是非激素依赖型前列腺癌提供了新的方法。 

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