靶向survivin siRNA与5Fu协同抑制MCF7细胞增殖

作者：薛兴欢    作者单位：710004 西安交通大学医学院第二附属医院肿瘤科     【摘要】  目的 研究以survivin为靶标的小干扰RNA（siRNA）与化疗药5Fu联合应用抑制MCF7细胞增殖的作用。方法 以脂质体为载体，将survivin siRNA转染至MCF7细胞中，用四氮唑盐（MTT）法染色并计算siRNA联用5Fu对MCF7细胞的抑制率，用SAS统计软件及金正均Q值法进行统计分析。结果 单用5Fu，IC50为4.42μg/ml；加入5nmol/L siRNA后，IC50降为1.18μg/ml；siRNA与5Fu联用的抑制作用较单用5Fu强（F=26.74，P＜0.01)；Q值分析表明survivin siRNA与中低浓度的5Fu联用，有较好的协同作用（Q≥1.15）。结论 survivin siRNA与5Fu联用，可显著增强对MCF7细胞增殖的抑制,提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。

    【关键词】  RNA干扰 化学疗法 联合治 MCF7

    目前化疗存在两个主要缺点,一是化疗药物对正常细胞的毒性,二是肿瘤细胞对化疗药物的耐药性。本研究通过RNA干扰技术靶向抑制调节细胞凋亡的survivin基因的表达，旨在研究survivin siRNA诱导乳腺癌细胞MCF7凋亡和提高其对常用抗肿瘤药物敏感性的作用，探讨survivin基因用于肿瘤基因治疗的可能性。

    1  材料与方法

    1.1  主要试剂

    LipofectamineTM2000购自美国Invitrogen公司，四氮唑盐（MTS）购自美国Promega公司，5氟尿嘧啶（5Fu）购自天津人民制药厂（生产批号：0204242）。

    1.2  细胞培养

    MCF7细胞组织来源为人乳腺癌,上皮样贴壁生长，购于北京大学医学部分子生物中心。3天左右传代一次,0.25%胰蛋白酶消化,新鲜配制含 10%胎牛血清的PRMI1640培养基在37℃、5% CO2及饱和湿度环境下培养。

    1.3  survivin siRNA的制备

    根据Elbashir等[1]确定的siRNA的特点，利用T7RNA聚合酶体外转录合成siRNA的方法[2]，筛选出了一条RNA干扰survivin基因的靶序列。这条序列通过计算机经BLAST检索证明与survivin以外的人类基因无同源性。    survivin  Target mRNA  5′  GTCTGGCGTAAGATGATGG    3′

    siRNA  5′  GUCUGGCGUAAGAUGAUGGUU3′Sene strand

    3′  UUCAGACCGCAUUCUACUACC5′Antisense strand1.4  联合用药体外抗肿瘤活性测定

    在96孔细胞培养板中，每孔加入含4×103个MCF7细胞的100μl培养液，置37℃、5％CO2孵箱培养24h。在无血清无双抗状态下，用脂质体LipofectinTM2000，按其说明书进行siRNA的转染，siRNA的最终浓度为5nM。 转染6h后，换含不同浓度5Fu的培养液100μl。化疗药物5Fu取其IC50上下的5个浓度（IC50为5Fu对经脂质体处理后的MCF7细胞的半数致死剂量）（5Fu：1.25、2.5、5、10、20μg/ml）分别与siRNA相组合，每种浓度组合重复4孔，以单用siRNA及单用5Fu（预先经脂质体处理）作为单药对照组，以经脂质体处理后不加药组作为空白对照。继续培养48h后，每孔加20μl MTS，置于37℃、5％CO2孵箱90min后，用多功能酶标仪测定吸光度A490nm，并计算细胞增殖抑制率I。

    I%=（A对照-A测定）/（A对照-A空白）×100%

    1．5  统计学方法

    采用SAS统计软件进行析因分析。

    1．6  协同作用分析方法

    评价联合用药对肿瘤细胞的抑制是否有协同作用，参照文献[3，4]以金正均Q值法判断：Q=Ea+b/(Ea+Eb-Ea×Eb)，其中Ea+b为合并用药的抑制率，Ea和Eb分别为A药和B药单独用药的抑制率。式中分子代表“实测合并效应”，分母是“期望合并效应”，Q是两者之比。Q＜0.85为拮抗，0.85≤Q＜1.15为相加，Q≥1.15为协同。

    2  结果

    2．1  联合用药对MCF7细胞增殖的抑制

    图1表明，单用5Fu，IC50为4.42μg/ml；加入5nmol/L siRNA后，IC50降为1.18μg/ml。上述结果说明在化疗药物中加入survivin siRNA后，药物对MCF7的抑制效果均有明显增加，并且可以看出随着化疗药物浓度的增加，抑制率增高的趋势均逐渐变缓。

    2.2  对化疗药物5Fu与siRNA联用进行析因设计的方差分析

    采用SAS统计软件对以上数据进行分析，siRNA+5Fu的F值为26.74，P值均<0.01。

    2.3  survivin siRNA与化疗药物5Fu之间的交互作用分析

    采用药理学上较为经典的方法即金正均Q值法[3,4]分析两药之间的交互作用。由表1中Q值可以看出，在5Fu为低浓度时，与siRNA联合用药均可得到较好的协同作用（Q≥1.15），升高5Fu浓度后，协同作用下降，直至转为相加作用，但没有出现拮抗作用。表1  siRNA与5Fu联合用药对MCF7细胞抑制率的协同性观察

    3  讨论

    乳腺癌的发生发展是一个多步骤、多因素的复杂过程。在此过程中，凋亡抑制基因survivin通过抑制凋亡蛋白酶，干扰细胞周期，使已转化的细胞进行异常有丝分裂，导致乳腺上皮细胞的永生化或癌变。研究表明乳腺癌组织中survivin的表达率可达72.3%[5] 。而RNA干扰（RNAi）是通过人为引入与内源靶基因具有相同序列的双链RNA，诱导内源靶基因的mRNA降解，阻止基因表达，达到基因治疗的目的[6,7]。

    3．1  survivin siRNA与乳腺癌细胞MCF7对5Fu的敏感性

    5Fu是影响核酸生物合成的药物，是抗代谢药物之一。这类药物模拟正常代谢物质，如叶酸、嘌呤碱、嘧啶碱等的化学结构，在细胞周期S期与有关代谢物质发生特异性的拮抗作用，从而干扰核酸，尤其是DNA的生物合成，阻止瘤细胞的分裂繁殖5Fu对多种肿瘤有效，特别是对消化道癌症和乳腺癌疗效较好。

    我们在实验中用survivn siRNA转染人乳腺癌细胞，以IC50(50％ inhibitionconcentration)来表示乳腺癌细胞对化疗药物的敏感性。IC50越小，表示肿瘤细胞对化疗药物的敏感性越大；反之则表示敏感性越小。结果，siRNA转染细胞的IC50明显降低，对5Fu的敏感性增加。用SAS统计软件分析联合用药后药物对MCF7细胞增殖的抑制作用，表明5Fu与survivin siRNA之间的交互作用对结果起到了极显著的影响（P<0.001）。其中，低剂量的5Fu（<5μg/ml）不同程度地与siRNA有协同作用（Q≥1.15）。随着化疗药物浓度的增加，协同作用降低，但在所取浓度范围内都没有出现拮抗作用。提示化疗药物与survivin siRNA联合用药, 可作用于细胞周期的不同环节, 降低细胞凋亡的阈值( threshold)，抑制肿瘤细胞增殖,促使肿瘤细胞凋亡增加,确实可以提高药物敏感性，降低化疗药物的剂量。

    3．2  survivin siRNA与常规化疗药耐药性和毒性

    研究发现胰腺癌细胞经X线照射后，survivin mRNA表达逐步升高，X线治疗后，survivin高表达的肿瘤细胞克隆形成率明显高于survivin弱表达的肿瘤细胞，可见，恶性细胞通过表达高水平survivin，可在化学治疗或放射治疗等细胞毒性状况下生存，从而获得化学抵抗[8]。在对食管癌化学治疗敏感性的研究中，对治疗部分反应的病人survivin mRNA水平明显低于对治疗无效和进展期病人[9]。Ikeguchi 等 [10]用顺铂治疗后，胃癌细胞survivin mRNA和蛋白表达水平升高，治疗后48h，mRNA 水平比未治疗细胞升高2 ～6倍，治疗后24h蛋白水平比未治疗升高3～6.5倍，提示survivin可能介导了细胞对顺铂治疗的抵抗。上述研究都提示了survivin在恶性细胞对放、化疗抵抗中起重要作用。这可能由于survivin既调节凋亡，又控制有丝分裂，维持肿瘤细胞生存。在细胞分裂中，survivin控制微管稳定性，装配正常的有丝分裂纺锤体，其过表达有助于细胞逃逸化学治疗和放射治疗诱导的G2/M期凋亡检查点，促进肿瘤细胞对放、化疗的抵抗作用，而siRNA转染能封闭survivin的表达，在一定程度上使细胞耐药逆转。

    可见，survivin siRNA与小剂量化疗药物5Fu联用既可以提高疗效，还可以降低抗癌药物使用剂量，这将有助于克服单用化疗药所引起的毒副作用大的缺点，并有助于解决单用siRNA治疗难以完全抑制肿瘤的生长且成本较高等问题。另外， survivin蛋白表达所引起的乳腺癌细胞凋亡机制的缺陷,在一定程度上参与了乳腺癌细胞对化疗药物耐药性的产生。对于癌症晚期及不适于手术治疗的癌症病人，siRNA和化疗药物联用有其独特的优势和光明的前景，值得在相互作用的分子机制方面进行深入研究。

【参考文献】[1]Elbashir SM, Harborth J , Lendeckel W, et al . Duplex of 21 23 nucleotide RNAs mediate RNA interferen in cultured mammalian cells[J].Nature,2001,411(6836)：494498.

[2] 张淑群,杜清友,杨英,等. Polymerase synthesis and potential interference of a small interfering RNA targeting hPim2[J].World Journal of Gastroenternology,2004,10(18):26572660.

[3] 戴体俊.合并用药的定量分析[J].中国药理学通报，1980，14(5)：479480.

[4] 金正均.合并用药中的相加[J].中国药理学报，1980，1(1)：7076.

[5] 张淑群,强水云,杨文彬,等.survivin蛋白在乳腺癌发生、发展不同阶段的表达及意义[J].癌症,2004,23(6):697700.

[6] Sohail M,Doran G,Riedemann J, et al. A simple and cost effective method for producing small interfering RNAs with high efficacy[J].Nucleic Acids Res, 2003, 31 (7)：e3842.

[7] Wilda M,Fuchs U,Wossmann W,et al. Killing of leukemic cells with a BCR/ABL fusion gene by RNA interference (RNAi)[J].Oncogene,2002,21(37):57165724.

[8] Asanuma K, Moriai R, Yajima T,et al. Survivin as a radioresistance factor in pancreatic cancer [J]. Jpn J Cancer Res,2000,91(11):12041209.

[9] Kato J, Kuwabara Y,Mitani M,et al. Expression of survivin in esophageal cancer:correlation with the prognosis and response to chemotherapy[J].Int J Cancer,2001,95(2):9295.

[10]Ikeguchi M, Liu J, Kaibara N. Expression of survivin mRNA and protein in gastric cancer cell line(MKN45) during cisplatin treatment[J]. Apoptosis,2002,7(1):2326.