人β防御素2在肺癌组织中的表达水平及其临床意义

作者：熊盛道    作者单位：430030 武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院呼吸内科卫生部重点实验室 【摘要】  目的 探讨人β防御素2(hBD2)在肺癌组织中的表达及其临床意义。 方法 收集32例不同类型肺癌的标本，每份标本取癌组织及癌旁正常组织。采用免疫组化及Western blot检测其hBD2的表达，并作半定量分析。结果 hBD2在癌组织中的表达高于正常组织，其表达在不同的临床分期之间存在显著性差异，而在不同病理类型的癌症组织中的表达差异无统计学意义。同样，免疫组化显示hBD2在肺癌组织表达较正常组织高。结论 人β防御素2可能参与肺癌的发病机制，其表达水平可能与肺癌病情进展有关。

【关键词】  β防御素 2 肺癌 蛋白质印迹 免疫组织化学

    人β防御素2（hBD2)是一种富含半胱氨酸、由41个氨基酸残基组成的小分子多肽[1]。hBD2与其他防御素家族成员一样，基因定位于人的8p22～p23.1[2]。依据一级结构和二硫键形成次序不同，防御素可分为α和β两个亚家族，α防御素由中性粒细胞和小肠潘氏细胞合成并储藏于胞浆颗粒中，β防御素主要由于上皮细胞合成和分泌。hBD2在微生物入侵的天然免疫和获得免疫中均起着重要的作用。在肿瘤方面，Ganz曾报道过防御素能够裂解肿瘤细胞，以后也有一些关于防御素细胞毒作用的报道[3]，然而hBD2在肺癌方面的研究尚少。本文拟检测hBD2在肺癌组织及癌旁正常组织的表达水平，探讨其临床意义。

    1  材料和方法

    1．1  试剂

    一抗AntihBD2购自Manufacturing & Developing Recombinant Cytokines，辣根酶标记兔抗山羊IgG(H+L)购自北京中山生物技术有限公司。免疫组化试剂盒及其余试剂购自武汉凌飞公司。

    1.2  病例和组织标本

    病例和标本取自华中科技大学同济医学院附属同济医院胸外科2005年11月～2006年2月共32例肺癌标本（包括12例小细胞肺癌和20例非小细胞肺癌），每例标本切下后均立即收集癌组织及其周边正常肺组织（距肿瘤边缘>5cm，经病检证实）置于－75℃冰箱内保存，所有病例在术前均没有接受放化疗处理。

    1． 3  方法

    1．3．1  组织总蛋白的提取  参照<分子克隆实验指南>第3版，采用裂解缓冲液进行组织总蛋白的提取[4]。

    1．3．2  蛋白浓度的测定  用pharmacia biotech 公司生产的Ulterspec紫外/可见光分光光度仪进行直接蛋白浓度的测度。

    1．3．3  Western blot印迹  每例标本取总蛋白50μg，采用TricineSDSPAG电泳中小分子多肽分离方法。蛋白分层后，用60V电压2h将蛋白转移到PVDF膜上，5%脱膜奶封闭1h，按0.2μg/ml的浓度加入一抗（AntihBD2、βactin抗体）37℃孵育2h，抗体洗脱液TBST洗3次，每次10min。按1∶500加入辣根酶标记兔抗山羊IgG(H+L)二抗37℃孵育2h，TBST在脱色摇床上洗2次，每次10min。加ECL发光剂，显影、定影。X光片洗涤干燥后，并登记记录。

    1．3．4  X光片显影结果测定  用Biorad对实验所得X光片显影结果进行灰度扫描。测定目的条带的灰度值、βactin灰度值及二者比值。

    1．3．5  免疫组化法  将制好的石蜡组织切片，经二甲苯脱蜡及梯度酒精水化后，0．01mol/L枸橼酸缓冲液中100℃持续15min进行抗原修复，免疫组化染色按SP试剂盒说明书进行。

    1．4  统计学方法

    组间显著性差异检验以t及校正t检验进行，P<0.05为差异有统计学意义。hBD2的表达与临床分期的关系采用Fisher LSD作方差分析。所有数据采用SPSS11.5软件作统计学处理。

    2  结果

    2．1  癌症组和正常组的Western blot结果见图1。

    上一条带1、2、3、4为对应Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期的正常组织，5、6、7、8为相应不同分期的癌组织；下一条带为相应标本的βactin内参照

    图1  肺癌组和正常组的Western blot杂交结果

    2．2  肺癌患者癌组织与非癌组织中hBD2与βactin灰度值比值的±s分别为(0.78±0.29)和(0.43±0.18)，采用t检验得知其分别来自不同的总体，其结果差异有统计学意义。

    2．3  根据性别分组其中男21例，其灰度值±s为（0.72±0.15）；女11例，灰度值±s为（0.85±0.29），采用校正t检验其结果差异并无统计学意义。按年龄分组，≤60岁13例和>60岁19例分组及组织病理类型分组，小细胞肺癌组12例和非小细胞肺癌组20例，采用校正t检验其±s值之间差异也无统计学意义。

    2．4  不同临床分期患者癌组织与非癌组织中hBD2的表达  见表1。表1  不同临床分期患者癌组织与非癌组织中hBD2的表达 注:*癌组织与非癌组织之间比较， Ｐ<0.05    在对不同TNM分期的4期比值结果采用SPSS11.5统计软件进行Fisher LSD方差分析： F=108.625，P=0.000，由此可知4期之间比值差异有统计学意义。同时TNM  4期癌症组织中的hBD2与βactin灰度值比值差异表现为Ⅰ期<Ⅱ期<Ⅲ期<Ⅳ期，可见各期比值的均数随着分期的增加而增加。其表现与图1中hBD2的表达结果基本吻合。

    2. 5  癌旁正常组织、小细胞肺癌及非小细胞肺癌染色组化结果见图2。

    3  讨论

    近年来，我国肺癌的发病率居高不下。在肺癌的治疗中，通过各种方法的联合使用，虽然取得了一定的疗效，但结果并不令人满意。因此对肺癌发生、发展的机制进行进一步的探讨具有重要意义，可能为肺癌的研究提供一个新的切入点。

    Ganz等在纯化的防御素对人及小鼠肿瘤的作用的研究中发现，防御素能杀伤多种肿瘤细胞，特别是对抗肿瘤坏死因子的细胞系和抗NK细胞毒因子的细胞系。它能和靶细胞膜结合，引起细胞骨架易位，从而灭活靶细胞；同时还发现其活性由微丝、钙调节蛋白和溶酶体调节，裂解作用呈剂量和时间依赖性[5]。Biragyn等[6]研究认为：β防御素是作为一种内源性TOLL样受体4（Tolllike Receptor 4,TLR4）的配体，与肿瘤的抗原结合后，直接作用于

    a:小细胞肺癌经DAB染色后，图中棕黄色为阳性显色，细胞内外均可见到；b:非小细胞肺癌同A处理后；c:正常组织DAB显色

    图2  小细胞癌组织、非小细胞癌组织、正常肺组织中hBD2蛋白表达的免疫组化染色结果（SP法，×100)

    未发育成熟的树突状细胞，让其发育成熟，从而在肿瘤免疫中发挥重要作用。

    在肺外其他组织的研究中也发现hBD2在肿瘤免疫中有其独特的作用。在口腔肿瘤的hBD2研究中，通过原位杂交法定性定位及PCR半定量分析发现：口腔肿瘤病变组织周围的Langerhan细胞内也有hBD2的高表达现象，通过对培养口腔癌SCC9细胞株给予LPS和TNFα刺激，hBD2的表达水平会随刺激而增强[7]。Halder等[8]人在通过对各种恶性肿瘤如：浆细胞癌、肺癌、慢性粒细胞性白血病的研究中发现，hBD2能与一些细胞因子如TNFα相互作用或激活细胞的表面受体而裂解肿瘤细胞。

    本研究通过对hBD2在肺癌及癌周正常组织配对样本进行Western blot半定量分析表明：癌症组织中hBD2的表达与其在癌周正常组织中的表达的差异具有统计学意义，提示hBD2可能参与肺癌的发病机制。结合临床资料显示Western blot杂交半定量值与肺癌患者的年龄、性别及肿瘤的组织学类型无关。与肺癌患者TNM分期呈一定程度的正相关性，而随着癌症的进展其表达逐渐增加，提示其表达水平可能作为肺癌预后评价指标之一。由免疫组织化学图片可知hBD2在肺癌组织分布较广泛，而在正常组织分布较少，hBD2不仅存在于细胞胞浆内，在细胞膜及细胞间隙也可见其阳性染色。因此，采用快速组织化学原位染色有可能为临床手术范围提供参考。而且研究hBD2参与肺癌的发病机制可能为癌症的治疗提供新的切入点。

    由于本实验样本数量有限，采取针对hBD2的有关治疗是否有效还有待进一步的实验验证，同时其具体发病机制也需要进行更深一步的研究。

【参考文献】  ［1］ Harder J, Bartels E, Christophers JM, et al. Isolation and characterization of human beta defensin 3, anovel human inducible peptide antibiotic [J]. Biochem, 2003, 276(8): 57075715.

［2］ Harder J, Siebert R, Zhang Y, et al. Mapping of the genneencoding human beta defensin 2 (DEFB2) to chromosome region 8p22p23.1[J]. Genomics, 1997, 46(3): 472480.

［3］ Lichtenstern A, GanZ T, Eselsted M, et al. In vitro tumor cell cytolysis mediated By peptide defensins of human and rabbit granulocytes[J]. Blood, 1986, 68(6): 14071415.

［4］ J 萨姆布鲁克，EF 费里奇，T曼尼阿蒂斯．分子克隆实验指南[M] ．金冬雁，黎孟枫，张励，等译．北京：科学出版社，1996．881887．

［5］ Alan KL, Tomas Ganz, Theminh Ngvgen, et al. Mechanism of target cytolysis by peptide defensins: Target cell metabolic activities, possibly involving endocytosis, are crucial for expression of cytotoxicity[J]. J immunol, 1998, 146(15): 24862694.

［6］ Biragyn A, Ruffini PA, Leifer CA, et al. Tolllike receptor 4dependent activiation of dendritic cells by βdefensin 2[J]. Science, 2002,298(1): 10251029.

［7］ Mizukawa N, Sugiyama K, Ueno T, et al. Defensin1 an antimicrobial peptide present in the saliva of patients with oral disease[J]. Oral Dis, 1999, 5(2): 139142.

［8］ Halder TM, Bluggel M, Heinzel S, et al. Defensins are dominant HLADRassociated selfpeptides from CD34 peripheral blood mononuclear cells of different tumor patients(plasmacytoma, chronic myeloid leukemia)[J]. Blood, 2000, 95(9): 28902896.