环磷酰胺联合卡介苗对Lewis肺癌小鼠CD4+CD25+Treg细胞及效应细胞功能的影响

作者：李欣, 崔永生, 刘白楠, 李 一    作者单位：长春，吉林大学基础医学院免疫学教研室；2. 吉林大学一医院胸外科 　　【摘要】  Function of CD4+CD25+Treg and Effecter Cells of Mice with Lewis Lung Cancer Were Influenced by CTX and BCG Therapeutic Alliance LI Xin1, CUI Yongsheng1,2, LIU Bainan1, LI Yi11.Department of Immunology, School of Basic Medical Sciences, Jilin University, Changchun 130021,China; 2.Department of Thoracic Surgery, First Hospital, Jilin University　　Corresponding Author: LI Yi, Email:yilili19@yahoo.com.cnAbstract：Objective To study the function of CD4+CD25+Treg and effecter cells of mice with Lewis lung cancer were influenced by CTX and BCG therapeutic alliance, investigate the relationship of CD4+CD25+ Treg and the tumor, and provide experiment evidence for the tumor immunotherapy. MethodsThe models were established by injected CTX (25mg/kg) and after 7 days injected subcutaneously to the right axilla of C57BL/6 mice with subculturing Lewis lung cancer cells and BCG (12.5mg/kg). The dynamic changes of tumor volume were observed. The changes of number of CD4+CD25+ Treg and the expression of Foxp3 in spleen were detected by flow cytometer and semiquantitative RTPCR. The changes of T lymphocyte proliferation and killing function spleen were detected. Results The tumor volumes grew more slowly in CTX and BCG therapeutic alliance group than in the tumor group. The number of CD4+CD25+ Treg in spleen of mice was lower in therapeutic alliance group than in the tumor group (P<0.05). The expression of Foxp3 mRNA in spleen lymphocyte was significantly lower in therapeutic alliance group than in the tumor group (P<0.05). The changes of T lymphocyte proliferation in spleen were significantly higher in therapeutic alliance group than in the tumor group(P<0.05). The changes of T lymphocyte killing function in spleen was not significantly lower in therapeutic alliance group than in the tumor group (P>0.05). Conclusion After CTX and BCG therapeutic alliance, the number of CD4+CD25+ Treg and the expression of Foxp3 mRNA in spleen of mice with Lewis lung cancer decreased, and enhanced the immune response to tumor, this may delay the growth of the tumor.　　Key words：CTX; Treg; Foxp3; Tumor immunity 　　【关键词】  CTX; Treg; Foxp3; 肿瘤免疫　　CD4+CD25+调节性T细胞(regulatory T cell, Treg)是一具有免疫调节（或免疫抑制）作用的细胞群，占CD4+T细胞5%～15%[1]。近年来发现具有免疫调节功能的CD4+CD25+ Treg细胞在保持自身耐受和免疫稳定的同时，也可能以某种机制抑制着免疫系统对肿瘤细胞的免疫应答，从而影响着肿瘤的发生和发展[2]。　　环磷酰胺（CTX）除了对肿瘤细胞具有细胞毒作用外，近来研究显示CTX还可以通过影响免疫系统的功能而发挥其抗肿瘤功能[34]；卡介苗（BCG）具有激发免疫系统对肿瘤的免疫应答，促进机体抵御肿瘤的作用。因此本文采用CTX联合BCG治疗Lewis肺癌小鼠，观察其CD4+CD25+调节性T细胞变化，为肿瘤的免疫治疗提供实验依据。　　1  材料与方法　　1.1  材料　　CTX为江苏恒瑞医药股份有限公司产品；BCG为浙江万马药业有限公司产品；PEantiCD4+ 及FITC antiCD25+抗体购于基因公司；Trizol试剂购于GIBCO公司；AMV逆转录酶、RNasin与Ex Tag DNA聚合酶为TaKaRa公司产品；MTT 购于Sigma公司；酶标检测仪550型为BIORAD公司产品；流式细胞仪为BD公司产品。　　1.2  实验动物及分组 　　吉林大学实验动物中心提供近交系C57BL/6小鼠，32只，雄性，体重18～22g，4～6周龄。按每组8只随机分成对照组、肿瘤组、CTX组和联合治疗组。Lewis肺癌细胞1×106个/只，接种于小鼠右腋皮下制备Lewis肺癌肿瘤组模型；小鼠腹腔注射CTX(25mg/kg) 7天后，接种Lewis肺癌细胞1×106个/只于小鼠右腋皮下，制备CTX单独治疗组模型；小鼠腹腔注射CTX(25mg/kg) 7天后，腹腔注射BCG（12.5mg/kg），同时接种Lewis肺癌细胞1×106个/只于小鼠右腋皮下制备联合治疗组模型；对照组为小鼠右腋皮下注射等量生理盐水。　　1.3  观测指标及方法　　1.3.1  肿瘤体积变化  自第7天起，每3天用游标卡尺测量每只小鼠腋下肿瘤长径（L）和短径（W），用Steel公式计算肿瘤体积：V=LW2 /2。　　1.3.2  脾脏CD4+CD25+ Treg细胞含量的测定  将小鼠颈椎脱臼处死，制备脾细胞悬液，TrisNH4Cl溶胀红细胞，取1×106个细胞（100μ l体积），加入PEantiCD4+ 和FITC antiCD25+ 抗体，用流式细胞仪检测脾脏CD4+CD25+ Treg细胞数量。　　1.3.3  脾脏Foxp3 mRNA表达测定  用Trizol试剂提取脾脏组织中的总RNA，并进行逆转录反应。小鼠Foxp3引物序列上游为5′CAGCTGCCTACAGTGCCCCTAG3′ ，下游为5′CATTTGCCAGCAGTGGGTAG3′ ，扩增片断大小为382bp，反应条件为94℃变性30s，58℃复性30s，72℃延伸30s，进行36个循环后进一步延伸72℃ 10min。选取βactin为内参照，取5μl PCR产物用1.5%的普通琼脂糖凝胶电泳后，凝胶电泳成像系统观测成像情况。　　1.3.4  脾脏T淋巴细胞的增殖情况测定  取96孔培养板加入1×106个脾细胞悬液, 加入ConA，终浓度为5μg/ml, 置37℃、5%  CO2培养箱内培养48h后每孔加入5mg/ml   MTT  10μl, 继续培养4h, 每孔加入DMSO  100μl, 在酶标仪上于570nm读取吸光度(OD值)。　　1.3.5  脾脏T淋巴细胞杀伤功能测定  取96孔培养板每孔加P815细胞5×104个,置于37℃、5%  CO2孵箱过夜。次日处死对照组、肿瘤组、CTX单独治疗组和联合治疗组小鼠,取脾细胞后用含10%小牛血清的IMDM培养液调整细胞浓度,使效靶细胞比分别为20∶1,按100μl/孔×3 孔加入上述含靶细胞的96孔培养板。采用定量乳酸脱氢酶(LDH) 法检测CTLs。　　1.3.6  统计学方法  采用SPSS10.0统计软件包处理数据。实验结果以±s表示，组间比较采用t检验法， P<0.05为差异有统计学意义。　　2  结果 　　2.1  肿瘤体积动态变化和生长曲线　　自接种肿瘤细胞第7天开始测量肿瘤体积，每隔3天检测一次。肿瘤体积变化随时间的推移呈对数增长，见图1。结果显示联合治疗组与CTX单独治疗组相比可明显延缓肿瘤的生长。　　2.2  CTX联合BCG对小鼠脾脏CD4+CD25+ Treg细胞数量影响　　结果显示肿瘤组脾脏CD4+CD25+ Treg细胞数量明显高于对照组（P<0.05），联合治疗组CD4+CD25+ Treg细胞数量比肿瘤组低（P<0.05）；联合治疗组CD4+CD25+ Treg细胞数量明显低于肿瘤组，但略高于CTX组，见图2。可能为BCG活化CD4+T细胞，使CD25表达上调，因此CD4+CD25+ Treg对肿瘤免疫抑制作用可能降低，同时又可能增强效应细胞功能。　　2.3  CTX联合BCG对小鼠脾脏Foxp3 mRNA表达的影响对照组脾脏Foxp3 mRNA表达水平为（0.525±0.199），肿瘤组Foxp3 mRNA表达水平为（1.375±1.187），CTX组Foxp3 mRNA表达水平为（0.947±0.373）,联合治疗组Foxp3 mRNA表达水平为（0.394±0.197）。电泳结果见图3。显示肿瘤组小鼠脾脏Foxp3 mRNA表达明显增高，联合治疗组表达水平明显低于肿瘤组（P<0.05）,但CTX组表达水平仍高于正常对照组。表明在肿瘤发生时Foxp3表达明显增高，而CTX联合BCG治疗可降低其表达。  组SI为（1.184±0.261），CTX单独治疗组SI为（1.412±0.119）, 联合治疗组SI为（1.747±0.108）。联合治疗组小鼠T淋巴细胞功能明显高于肿瘤组（P<0.05），略高于CTX单独治疗组。结果显示CTX与BCG联合治疗可提高脾脏T淋巴细胞功能，从而有可能提高机体抗肿瘤免疫。　　2.5  CTX联合BCG对小鼠脾脏T淋巴细胞杀伤功能的影响　　对照组脾脏T淋巴细胞杀伤率为0.338±0.093，肿瘤组杀伤率为0.218±0.051，CTX单独治疗组杀伤率为0.289±0.055，联合治疗组杀伤率为0.285±0.049。结果显示CTX与BCG联合治疗组小鼠脾脏T淋巴细胞杀伤活性比肿瘤组略高，但变化不显著（P>0.05）。　　3  讨论　　自1995年Sakaguchi等人首先提出CD4+CD25+调节性T细胞之后，引起了免疫学界越来越多的关注，先后对其进行了广泛的研究[1，5]。CD4+CD25+Treg细胞是自然产生并成熟于胸腺的独特细胞群。对其在体内的生物学效应的研究发现，具有免疫调节功能的CD4+CD25+Treg细胞在保持自身耐受和免疫稳定的同时，也参与对肿瘤免疫应答的抑制[6]。因此，CD4+CD25+Treg细胞不但在肿瘤逃逸、促进肿瘤的生长中发挥作用，也可能是肿瘤疫苗和免疫增强剂难以奏效的原因。　　环磷酰胺广泛应用于多种癌症的治疗[78]；同时它可用于自身免疫等疾病的治疗。低剂量CTX可能通过足够清除CD4+CD25+Treg细胞并恢复其体内效应T细胞的抗肿瘤活性，从而增强抗肿瘤免疫[ 910]。我们研究发现联合治疗较单纯CTX治疗更能显著提高外周淋巴细胞的增殖功能，提示联合治疗在刺激效应细胞活化的同时，可降低CD4+CD25+Treg细胞对肿瘤效应细胞的抑制作用，使机体免疫系统有效地对肿瘤细胞进行杀伤。　　新的肿瘤治疗策略是在刺激肿瘤免疫应答的同时抑制或清除CD4+CD25+Treg细胞，使肿瘤免疫治疗更加有效和善。　　【参考文献】　　[1] Sakaguchi S, Sakaguchi N, Asano M, et al. 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