晚期消化道肿瘤患者化疗前后外周血血浆细胞因子的变化

作者：徐红    作者单位：215006 苏州大学附属第一医院肿瘤科；2. 苏州大学医学生物技术研究所免疫室     【摘要】  目的 检测消化道肿瘤患者化疗前后血浆细胞因子的变化，从而探讨化疗对不同患者机体免疫状态改变的影响及其临床意义。 方法 采用ELISA方法检测健康组、消化道肿瘤组、早期消化道肿瘤组及晚期消化道肿瘤组患者化疗前后血浆细胞因子的变化。 结果 消化道肿瘤患者组IL2的水平显著低于健康组（P<0.05），而其IL10和TNFα水平略高于健康组（Ｐ>0.05），以上结果与临床分期有关，即晚期患者IL2较早期患者更低（Ｐ<0.05），而IL10和TNFα则较早期患者更加升高。晚期消化道肿瘤患者化疗后1周，血浆IL2浓度较化疗前明显下降，处于极低水平，其中化疗无效组降低更为明显。化疗后2周起，化疗有效组患者IL2浓度逐渐回升并接近化疗前水平，化疗后3周其水平甚至显著超过化疗前水平（Ｐ<0.05）；而化疗无效组，IL2浓度虽有微弱回升但仍明显低于化疗前。血浆中IL10和TNFα的浓度却在化疗后呈现一个先增高后减低的趋势。 结论 消化道肿瘤患者机体免疫功能受到抑制，而且免疫抑制程度与其临床分期有关，早期患者的免疫抑制程度较轻，晚期患者的免疫抑制程度较重。晚期消化道肿瘤患者化疗后早期(1～2周)加剧了免疫抑制的程度，化疗有效患者，化疗后3周全身免疫状况改善；而化疗无效组未出现相应的免疫功能的改善，甚至呈现免疫功能的进一步恶化。

    【关键词】  晚期消化道肿瘤 化学治疗 细胞因子

    细胞因子是一组由免疫细胞和某些非免疫细胞经刺激而合成和分泌的具有多种生物学活性的蛋白质或多肽，通过与相应靶细胞上的特异性受体结合产生不同的生物学效应，具有介导和调节免疫应答及炎症反应、刺激造血、参与组织修复等功能。大量研究表明，细胞因子尤其是IL2、IL10和TNFα在肿瘤免疫过程中起着重要作用。本研究采用ELISA法（酶联免疫吸附试验）检测了晚期消化道肿瘤患者化疗前、后外周血血浆细胞因子IL2、IL10和TNFα的阶段性表达情况，并对其在晚期消化道肿瘤患者化疗过程中的作用进行了初步探讨，为晚期消化道肿瘤患者的适时免疫治疗提供一定的依据。

    1  资料与方法

    1．1  临床资料

    全部病例组为苏州大学附属第一医院2005年9月～2006年4月间入院的消化道肿瘤患者104例，其中未化疗组23例，早期化疗组26例，晚期化疗组55例，年龄45～76岁，平均年龄57.6岁，经病理切片确诊，行消化道肿瘤标准手术及手术后系统的化疗（OLF、FOLFOX等方案），化疗近期未接受免疫抑制剂和其他对免疫功能有影响的药物，无其他内科合并症。疗程结束后，近期疗效按全国实体瘤疗效评定标准判定，所有病例组男女比例为2∶1，胃癌与肠癌的比例为1∶3。健康对照组为苏州大学附属第一医院门诊体检健康献血员，共25例，年龄48～62岁，平均年龄54.7岁，验血前3个月未接触任何免疫抑制剂，非妊娠期、非月经期、无内科合并症。标本采集：健康人、消化道肿瘤未化疗组和早期消化道肿瘤化疗组患者常规抽取外周血3ml送检；晚期消化道肿瘤化疗组患者分别于静脉化疗前1～2天，化疗后1周、2周和3周抽取外周血3ml送检。具体分组如下：第1组，健康对照组：25例，来自我院门诊体检的健康献血员；第2组，消化道肿瘤未化疗组：23例，来自我院普外科确诊的未经任何治疗的患者；第3组，早期消化道肿瘤化疗组：26例，来自我院肿瘤内科确诊的早期消化道肿瘤，处于化疗第3至第4周期的患者，其中Ⅰ期6例，Ⅱ期20例；第4组，晚期消化道肿瘤化疗组：55例，来自我院肿瘤内科确诊的晚期消化道肿瘤，处于化疗第3至第4周期的患者，其中Ⅲ期13例，Ⅳ期42例；第5组，根据化疗后的转归，在第4组患者再选择37例（其中胃癌8例，肠癌29例）进一步分为化疗有效组19例（其中完全缓解3例,部分缓解16例）和化疗无效组18例（其中无效7例,进展11例）。所有参加临床实验的健康人和患者均已签署知情同意书。

    1．2  检测方法

    采用酶联免疫双抗夹心法（ELISA）定量检测各细胞因子，人IL2、IL10、TNFα ELISA检测试剂盒（BD OptEIATM）购自美国BD Biosciences公司。检测仪为美国产BioRad酶联免疫检测仪。具体方法如下：（1）实验前将各种试剂和样品放置到室温（18℃～25℃）；（2）在板内各孔中加入50μl 稀释液；（3）吸取100μl已稀释至不同浓度的标准品和实验样品放入相应各孔，轻摇5s钟混匀。覆盖透明膜室温孵育2h；（4）弃取孔内样品，用洗涤液洗涤5遍，最后一遍应尽量弃尽孔内液体；（5）各孔内加入100μl检测液，覆盖透明膜室温孵育1h；（6）弃取孔内样品，用洗涤液洗涤7遍，最后一遍应尽量弃尽孔内液体；（7）各孔内加入100μl   TMB一步法底物反应液，室温避光（不覆盖透明膜）孵育30min；（8）每孔加入50μl终止液；（9）立刻（30min内）在酶标仪450nm处读取OD值；（10）以标准OD值绘制标准曲线，根据标准曲线及样本OD值得出样本中细胞因子的浓度。

    1．3  统计学方法

    各组外周血血浆细胞因子浓度检测结果以±s表示，显著性差异用配对t检验。

    2  结果

    2．1  消化道肿瘤患者各组与健康人组外周血血浆细胞因子（IL2、IL10和TNFα）浓度的比较

    采用酶联免疫吸附试验检测所有外周血血浆样本中的IL2、IL10和TNFα浓度，见表1、图1。结果显示，消化道肿瘤患者血浆中IL2的水平低于正常人组（P<0.05），而IL10和TNFα水平却高于正常人组（Ｐ>0.05），这与其他类型肿瘤患者的文献报告基本一致。值得注意的是，消化道肿瘤患者血浆中细胞因子的浓度与其临床分期也有一定相关性。肿瘤患者随分期加重，晚期患者IL2的水平较早期患者更低（Ｐ<0.05），而IL10和TNFα的水平则较早期患者有所升高（Ｐ>0.05）。

    2.2  静脉化疗对晚期消化道肿瘤患者外周血血浆细胞因子的影响

    采用酶联免疫吸附试验检测了37份晚期消化 表1  各组外周血血浆中IL2、IL10和TNFα浓度 注：健康组与未化疗组及早期化疗组与晚期化疗组间比较，IL2浓度的变化在两组间差异均具有统计学意义（* P<0.05）；而IL10和TNFα浓度的变化差异无统计学意义（P>0.05）表2  化疗对晚期消化道肿瘤患者血浆细胞因子浓度的影响(±s，ng/ml）注：化疗前组与化疗后1～3周组组间比较，在肿瘤化疗有效组，IL2浓度的变化在化疗前和化疗后第3周差异有统计学意义（* P<0.05）；而IL10和TNFα浓度在化疗前、后未见统计学上的差异。在肿瘤化疗无效组，IL2、IL10和TNFα浓度在化疗前、后各组中均未见统计学上的差异

    道肿瘤患者的外周血血浆样本中的IL2、IL10和TNFα浓度，结果见表2、图2。化疗后1周，晚期消化道肿瘤患者外周血血浆IL2浓度较化疗前明显下降，处于极低水平，以化疗无效组降低更为明显。化疗后2周起，化疗有效组IL2浓度逐渐回升接近化疗前水平，化疗后3周甚至显著超过化疗前水平（P<0.01），出现了免疫改善；而化疗无效组，化疗后3周IL2浓度虽有微弱回升但仍明显低于化疗前。

    而晚期消化道肿瘤患者外周血血浆中IL10和TNFα的浓度却在化疗后呈现一个先增高后减低 的趋势。化疗后1周，晚期消化道肿瘤患者外周血血浆IL10和TNFα浓度较化疗前升高，且化疗无效组升高更为显著。化疗后2周起，化疗有效组IL10和TNFα浓度逐渐降低接近甚至低于化疗前水平，化疗后3周这一趋势更加明显，但这些变化经统计学分析，差异无统计学意义（P>0.05）；而化疗无效组，IL10和TNFα浓度虽有减低但相对不明显，仍高于化疗前水平，提示免疫功能在化疗无效组未发生改善。

    3  讨论

    细胞因子是指一类由免疫细胞（淋巴细胞、单核巨噬细胞等）和非免疫细胞（如纤维母细胞、内皮细胞等）产生的调节细胞功能的高活性多功能蛋白质多肽。细胞因子在机体免疫应答、免疫调节及肿瘤等多种相关疾病的发生、发展和转归中起着非常重要的作用。大量研究表明，细胞因子尤其是IL2、IL10和TNFα在肿瘤免疫过程中起重要的作用。

    IL2是机体最主要、最强有力的T细胞生长因子，它是保障机体正常免疫功能的关键因素[1]。IL2的抗肿瘤作用不是直接杀伤肿瘤细胞，而是通过诱导和激活免疫细胞（T细胞、NK细胞等）杀伤肿瘤细胞[2]。在NKIL2IFNγ免疫调节系统中，NK细胞活化有赖于IL2，与此同时，IL2又能刺激T细胞释放IFNγ和增强IL2R的表达，而IFNγ促进NK细胞活性，使之产生IL2R，并促进IL2的释放[3]。而肿瘤患者IL2的产生减少，主要受到肿瘤细胞分泌的免疫抑制因子的影响。肿瘤患者由于IL2的产生减少，活性减弱，其免疫功能日渐低下，处于恶性循环状态。因此，IL2已成为肿瘤免疫治疗领域的一种主要细胞因子。

    我们的研究显示，消化道肿瘤患者血清中IL2的水平低于正常人组（P<0.05），且其浓度与临床分期相关。肿瘤患者随分期加重，免疫功能进一步受到抑制，晚期患者IL2较早期患者更低（P<0.05）。化疗后1周，晚期消化道肿瘤患者外周血血浆IL2浓度较化疗前明显下降，处于极低水平，以化疗无效组降低更为明显。化疗后2周起，化疗有效组IL2浓度逐渐回升接近化疗前水平，化疗后3周甚至显著超过化疗前水平（P<0.01）；而化疗无效组，IL2浓度虽有微弱回升但仍明显低于化疗前。外周血血浆IL2浓度的变化与分泌IL2的T细胞（CD3+T细胞、CD4+T细胞及初始T细胞）数量变化呈正相关，国外文献也有同样报道[46]。

    正常情况下，IL10主要由Th2细胞、单核/巨噬细胞、B淋巴细胞和角化细胞等产生。当机体发生肿瘤时，IL10的水平异常升高。Tabata等[7]用流式细胞技术检测消化系统肿瘤病人外周血淋巴细胞，发现IL4+/CD4+T细胞和IL10+/CD4+T细胞数量均显著高于正常对照组。在手术切除肿瘤后，IL4+/CD4+和IL10+/CD4+细胞数量均明显下降。用RTPCR方法检测IL10 mRNA在肿瘤组织中的表达，发现在多种肿瘤组织中均可检测到IL10，包括宫颈癌[8]、淋巴瘤[9]和黑色素瘤[10]等，而在正常组织中，IL10 mRNA不表达或表达量极少。大量的研究表明IL10是肿瘤发生发展过程中一种重要的免疫抑制因子。肿瘤细胞分泌IL10并通过抑制单核/巨噬细胞、Th细胞、CTL细胞、γδT细胞、NK细胞及其分泌的细胞因子来抑制机体对肿瘤的免疫，使肿瘤发生逃逸而得以发展。随着肿瘤的发展恶化，IL10的水平又会进一步升高，从而加重肿瘤的恶化，形成恶性循环。在手术或放化疗后好转的肿瘤病人中，他们的IL10水平较治疗前下降。因此现在有些学者提出可以用IL10作为诊断肿瘤和预后的一个指标[11]。

    TNFα（肿瘤坏死因子）来源于活化的单核细胞，是迄今发现的抗肿瘤作用最强的细胞因子[12]。肿瘤患者TNFα表达上调的同时，sTNFR亦出现表达的增高且更为显著。此时，sTNFR的明显上升除了由机体免疫细胞受肿瘤抗原刺激产生外，有部分为肿瘤本身所释放，而sTNFR表达上调完全抵抗了TNFα的抗肿瘤活性，这可能是肿瘤细胞逃避内源性TNFα攻击的机制之一[13]。

    本研究揭示，消化道肿瘤患者血清中IL10和TNFα水平高于正常人组（P>0.05），且与临床分期有一定的相关性，晚期患者IL10和TNFα较早期患者更高（P>0.05）。化疗对晚期消化道肿瘤患者外周血血浆中IL10和TNFα的浓度影响呈现一个先增高后减低的趋势。但在各组中均无统计学上的意义。尽管IL10和TNFα对晚期消化道肿瘤的诊断价值尚不能十分肯定，但是密切结合临床的综合分析，对其预后判断仍有一定的临床实用价值。

    当宿主免疫功能低下或受抑制时，肿瘤发病率增高。肿瘤发生后，机体可通过免疫效应机制特别是细胞免疫发挥抗肿瘤作用。在肿瘤进行性生长时，肿瘤患者的免疫功能受到抑制。现有化疗药物中的绝大多数在抑制肿瘤生长或杀伤肿瘤细胞的同时，对机体正常的细胞同样有损伤作用，尤其是对造血细胞与胃肠道粘膜上皮细胞的损伤，常常是提高化疗药物疗效的主要障碍。因此，化疗药物在治疗肿瘤的过程中，通常会对机体免疫系统产生一定的抑制。我们的研究显示，化疗后机体免疫力降低到恢复正常约有近1个月的“间期”，此期间机体抗瘤能力下降，需要一定的免疫支持。晚期肿瘤患者血浆中IL2等细胞因子的变化表明，化疗后3周化疗有效组全身免疫状况改善，而化疗无效组未出现相应免疫功能的改善，甚至呈现免疫功能的低下。化疗对晚期消化道肿瘤患者的免疫功能有明显的抑制效应，如果这种抑制状态不易纠正，将不利于机体长期抗肿瘤的需要。因此，在细胞因子的支持下，在免疫系统功能良好时给予大剂量的化疗有望提高治愈率或长期存活率。

    本研究采用ELISA法（酶联免疫吸附试验）检测了晚期消化道肿瘤患者化疗前、后外周血血浆细胞因子IL2、IL10和TNFα的阶段性表达情况，并对其在晚期消化道肿瘤患者化疗过程中的作用进行了初步探讨，这对反映机体的免疫状态有一定的临床意义，但必须动态观察整个过程。同时为晚期消化道肿瘤患者的适时的免疫治疗提供一定的依据。

    【参考文献】[1]马锐，柳星，伞宝君，等. 肿瘤化疗对细胞免疫系统的影响[J]. 中国实用内科杂志,2002,22(6):352353.

[2] 余传霖，叶天星，陆德源，等．现代医学免疫学[M]．上海：上海医科大学出版社，1998．132133.

[3] G Brunetti, A Bossi, P Baiardi， et al. Soluble interleukin 2 receptor(sIL2R) in monitoring advanced lung cancer during chemotherapy[J]. Lung Cancer, 1999， 23(1): 19.

[4] Whisler RL, Liu BQ, Chen M. Agerelated decreases in IL2 production by human T cells are associated with impaired activation of nuclear transcriptional factors AP1 and NFAT[J]. Cell. Immunol， 1996,169(2):185195.

[5] Liu BQ, Carle KW, Whisler RL. Reductions in theactivation of ERK and JNK are associated with decreased IL2 production in T cells from elderly humans stimulated by the TCR/CD3 complex and costimulatory signals[J]. Cell Immunol, 1997, 182(2):7988.

[6] Ginaldi L, De Martinis M, D'Ostilio A. The immune system in the elderly III[J]. Innate immunity Immunol Res， 1999, 20(2):117126.

[7] Tabata T，Hazama S，Yoshino S, et al. Th2 subset dominance among peripheral blood T lymphocytes in patients with digestive cancers[J]．Am J Surg，1999, 177(3)：203206.

[8] Sheu BC，Lin RH，Lien HC，et a1．Predominant Th2/Tc2 Polarity of TumorInfiltrating Lymphocytes in Human Cervical Cancer[J]．J Immunol，2001，167(5)：29722978.

[9] Urosevic M，Willers J，Mueller B，et a1．HLAG protein upregulation in primary cutaneous lymphomas is associated with interleukin10 expression in large cell Tcell lymphomas and indolent Bcell lymphomas[J]．Blood，2002，99(2)：609617.

[10]Lauerova L，Dusek L，Simickova M，et a1．Malignant melanoma associates with Th1/Th2 imbalance that coincides with disease progression and immunotherapy response[J]．Neoplasma，2002，49(3)：159166.

[11]M Naruke, Y Abe, H Hatanaka，et a1．Interleukin10 expression is correlated with growth fraction in human nonsmall cell lung cancer xenografts[J]．Int J Oncol,2001,18(6)：12131217.

[12]李桂香. 肺癌患者血浆中的肿瘤坏死因子、白细胞介素2水平测定的临床意义[J]. 标记免疫分析与临床, 1999, 6(2): 731.

[13]刘超，庞志刚，王广田. 射频热凝治疗对肝癌血浆肿瘤坏死因子及可溶性受体Ⅰ的影响[J]. 中国误诊学杂志, 2003,（04）:499500.