O6甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶的研究进展
发表时间:2009-06-24 浏览次数:548次
作者:朱凌冬,蔡景龙,远里美
【关键词】 O6甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶 MGMT DNA 修复酶 肿瘤
0 引言
O6甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(O6methylguanineDNA methyltransferase, MGMT)是一种高效的DNA直接修复酶,能修复DNA序列中的6氧甲基鸟嘌呤( O6methylguanine, O6mG)损伤,是人类细胞中迄今发现的唯一一种修复该损伤的甲基转移酶。
1 MGMT概述
1.1 基因结构 人类MGMT(hMGMT)基因定位于10q26,全长170 kb,含5个外显子,4个内含子。其启动子富含GC序列,缺乏TATA盒和CAAT盒。已确定的顺式作用元件有CpG岛中6个Spl位点、2个糖皮质激素反应元件(GRE)、AP1和AP2元件等。
1.2 基因多态性 MGMT有基因多态性现象。Imai等发现在MGMT基因外显子5第160位密码子处GGA→AGA,甘氨酸转换为精氨酸(G160R), 15%的日本人存在这种多态性,高加索和美国人群中均未发现该多态性。Deng等发现一种人类MGMT基因的错义多态性,发生在外显子5第143位密码子,ATC→GTC,异亮氨酸转换为撷氨酸(1 143V)。
1.3 蛋白质结构 hMGMT为单肽结构,含207个氨基酸残基,相对分子量为23 000,有13个保守氨基酸。在已知所有的MGMT中,均存在“Pro144Cys145His146Arg147(PHCR)”的基本结构,形成活力中心的一部分。 Cys145是最关键的氨基酸,它的SH直接参与转甲基作用,与甲基结合后形成S烷基半胱氨酸。His146、Arg147促进Cys145巯基离子的产生,有利于Cys145甲基结合,维持活力中心。虽对E.coli 6氧甲基嘌呤DNA甲基转移酶(Adac)的晶体结构已经弄清,但人们对hMGMT的三维结构尚不明了。
1.4 生物学功能 烷化剂能使DNA分子鸟嘌呤O6位发生烷基化。因为O6mG在复制过程中与T配对,导致DNA中G:C配对转换为A:T配对,并且O6鸟嘌呤加合物可与相对的胞嘧啶残基发生交联而封闭DNA复制,这是导致突变形成肿瘤的重要步骤。MGMT能将O6鸟嘌呤加合物从DNA上移除,可在突变发生以前中和这种损伤作用[1]。MGMT将鸟嘌呤O6的烷基转移到其活性部位的半胱氨酸残基上,形成S烷基半胱氨酸,使DNA恢复原貌。因其活力部位的Cys145与底物上甲基结合后就失去了活力,发生不可逆失活,因此MGMT被称为一种自杀蛋白。hMGMT主要转移O6mG上的甲基,对其他甲基化的碱基如O6乙基嘌呤、O6丁基嘌呤、O4甲基胸腺嘧啶的转移活力及转移效率均较低[2]。
1.5 基因的表达与调控 MGMT的表达在正常细胞中和在肿瘤细胞中都有很大差异。MGMT在不同的组织细胞内分布不同,绝大部分存在于胞浆内,DNA损伤后胞核内的含量才会增加[3]。hMGMT在细胞浆内合成,在细胞核发挥作用,hMGMT如何转运到细胞核,以及如何滞留在细胞核内发挥作用,尚不清楚。
有实验证据表明,DNA 损伤是诱导MGMT表达的重要细胞信号。Takahashi等报道,二甲基亚硝胺(DMN)可诱导MGMT mRNA在肝脏中的表达。电离、外线辐射、地塞米松及野生型p53蛋白可诱导MGMT的表达。
MGMT启动子高甲基化能抑制基因转录[4],染色质重塑通过组蛋白乙酞化酶(HAT)和组蛋白去乙酞化酶(HDAC)进行,Suzuki等研究发现结肠癌细胞中启动子高甲基化的基因的转录静止是依靠甲基化与HDAC活性之间的协同作用,其中甲基化占主导地位;而启动子未甲基化的基因表达则受组蛋白的修饰酶(HAT和HDAC)调控。
2 MGMT异常与肿瘤
2.1 MGMT异常与肿瘤的发生 烷化剂能使DNA鸟嘌呤O6位发生烷基化,如果MGMT异常,不能发挥正常的作用或作用不足,将导致DNA中G:C配对转换为A:T配对,就会导致癌基因的激活和抑癌基因失活,进一步发展引起肿瘤。Boley等发现,在N甲基N亚硝基脲(MNU)致成纤维细胞的恶性转化中,缺乏MGMT的细胞在明显较小计量MNU作用下就可以发生转化。在MNU致淋巴瘤的试验中,Allay等发现MGMT过度表达能明显降低淋巴瘤的发生率。某些有癌前病变倾向的病理组织中MGMT水平明显下降,如Sjogren综合征患者外周血淋巴细胞基肝硬化患者的肝组织中[5]。
MGMT基因结构功能的异常集中体现在其启动子过度甲基化,因此启动子过甲基化与肿瘤发生以及生物学上的联系正成为关注的焦点。鉴于MGMT基因的结构特点,启动子CpG岛的过甲基化将影响其空间构型和其与转录因子的结合能力,从而导致基因表达下降。Soejixna等研究46例肝细胞肝癌标本,并检测其MGMT基因启动子区域的97个CpG位点的甲基化情况,发现MGMT不表达的肿瘤组织甲基化的CpG位点数目明显多于MGMT表达的肿瘤组织和正常组织。Lind等检测69例睾丸肿瘤,发现MGMT基因启动子过甲基化也很普遍,有过甲基化的42例(46%),其比例甚至高于胃癌。最新研究表明,在肝癌和宫颈癌中,MGMT基因启动子过甲基化和肝炎病毒以及HPV感染有统计学上的明显相关性[6]。
2.2 MGMT异常与肿瘤临床特征
2.2.1 同一部位肿瘤,组织类型不同,MGMT启动子甲基化程度不同 非小细胞肺癌29%存在MGMT启动子甲基化,腺癌较其他组织学类型癌MGMT启动子甲基化多见。与p53未发生突变或发生其他突变的肿瘤相比较,MGMT启动子高甲基化在p53 发生GA突变的肿瘤中更常见[7]。
2.2.2 MGMT启动子甲基化发生率越高,MGMT含量越低,肿瘤恶性程度越高 有学者研究发现脑星性细胞瘤(WHO Ⅱ级)MGMT基因甲基化程度为22%,从低级星性细胞瘤恶化而来的胶质母细胞(WHO Ⅳ级)甲基化程度增高,达75%。研究还发现MGMT含量与肿瘤非整倍程度和异质性都有关。
2.2.3 与肿瘤转移及预后 胃癌MGMT启动子甲基化与淋巴结转移、肿瘤分期以及生存期有明显的相关性[8]。启动子甲基化程度越高,肿瘤预后越差,其对肿瘤预后及生存期的预示作用较肿瘤的分级、临床等其他特征更有效。
3 MGMT 在肿瘤诊断与治疗中的实际应用
3.1 MGMT在肿瘤诊断中的应用前景 根据MGMT在肿瘤组织中与正常组织中表达及启动子甲基化的不同,可为肿瘤的诊断提供新思路。如胃腺癌组织和肠上皮化生组织可检测到MGMT的表达,而正常胃上皮却没有,据此,MGMT检测可作为胃癌的辅助诊断手段。Palmisano等从已患肺鳞状细胞癌达3 年但尚没有临床症状的病人痰液中发现p16和MGMT基因启动子100%异常甲基化,这为肺癌的早期诊断提供了一种及时、有效、无创的方法[9]。MGMT基因启动子甲基化亦可作为在血清中探测肿瘤细胞的标志物,从而能开辟一种用这种标志物来探测肿瘤血行转移情况的新方法[10]。
3.2 MGMT在肿瘤治疗中的应用[11] 烷化剂化疗药对肿瘤的作用与对正常细胞的作用类似,主要作用机制是在肿瘤细胞DNA鸟嘌呤O6位形成具有毒性的加合物,并进一步导致DNA 的交联,产生细胞毒性作用,导致肿瘤细胞死亡。MGMT可以修复烷化剂化疗药造成的这种DNA损伤,使肿瘤细胞产生耐药基因。MGMT在以下两个方面得以应用。
3.2.1 增强烷化剂化疗药的疗效 因为MGMT可以修复烷化剂化疗药造成的DNA损伤,因此阻断MGMT的作用可明显增加这类化疗药疗效。目前研究较多的是O6苯甲基鸟嘌呤(O6benzylguanine,O6BG),它可作为O6甲基鸟嘌呤和氯乙基鸟嘌呤的替代物,消耗MGMT,快速使MGMT失活,与烷化剂化疗药联用明显增强化疗效果。
野生型p53能抑制肿瘤细胞MGMT表达及其活性,增加肿瘤细胞对烷化剂的敏感性,因而渴望其在肿瘤基因治疗中起到增强化疗疗效的作用。
3.2.2 减少化疗药引起的骨髓抑制 O6BG和一些烷化剂如ACNU、BCNU、TMZ联合使用虽然可以增强疗效,但同时也增加了骨髓抑制。为了消除MGMT消耗导致的骨髓损伤,可通过MGMT基因转入骨髓造血干细胞来抑制烷化剂化疗药的副作用,提高病人对化疗药的耐受性。 两种MGMT变异型P140A和P140A/G156A均可以抵抗O6BG对MGMT的消耗作用,目前已用于烷化剂抗肿瘤治疗。
4 问题与展望
随着人们对肿瘤研究的不断深入,人们对MGMT的研究已经成为热点,虽然对MGMT的基因结构、基因多态性有所了解,但对人hMGMT蛋白质的三维结构还不甚清楚;对MGMT 生物学作用机制研究的还不够深入。目前MGMT在肿瘤治疗中增强烷化剂化疗疗效、减少骨髓抑制副作用已得到了初步应用,这体现了MGMT在肿瘤治疗中应用前景,但MGMT 在这一领域的应用还存在一些问题,而且MGMT能否在其他领域内进行应用还有待进一步研究,我们相信这些问题将在不长时间内得到解决。渴望其在肿瘤基因治疗中起到增强化疗药的化疗作用。
【参考文献】 [1] Dolan ME, Schilsky RL. Silence is golden:gene hypermethylation and survival in largecell lymphoma[J]. National Cancer Institute,2002,94(1):67.
[2] Ishikawa T, Zhang SS, Qin X, et al. DNA repair and cancer: lessons from mutant mouse models[J]. Cancer Sci, 2004, 95(2):112117.
[3] Matsukura S, Soejima H, Nakagawachi T, et al. CpG methylation of MGMT and hMLMl promoter in hepatocellular carcinoma associated with hepatitis viral infection[J]. Br J Cancer, 2003, 88(4):521529.
[4] Costello FJ, Plass C. Methylation matters[J]. Med Genet, 2001, 38(5):285303.
[5] Wolf P, Hu YC, Doffer K, et al. O6methylguanine-DNA methyltransferase promoter hypermethylation shifts the p53 mutational spectrum in non-small cell lung cancer patients[J]. Cancer patients Res, 2001, 61(22): 81138117.
[6] Srivenugopal KS, AliOsman F. The DNA repair potein O6methylguanineDNA methyltransferase is a pfoteolytic target for the E6 human papillomavirus oneopmtein[J]. Oncogene, 2002, 21(38):59405945.
[7] Pollok KE. In vivo protection of hematopoietic cells from alkylator-mediated DNA damage[J]. Curr Hematol Rep, 2003, 2(4):341347.
[8] Park TJ, Han SU, Cho YK, et al. Methylation of O6MethylguanmeDNAMethyltransferase gene is associated significantly with Kras mutation, lymph node invation, tumor staging, and diseas free survia l in patients with gastric carcinomal[J]. Cancer, 2001, 92(11):27602768.
[9] Palmisano WA, Divine KK, Saccomanno G, et al. Predicting lung cancer by detecting aberrant promoter methylation in sputum[J]. Cancer, Res, 2000, 60(21):59545958.
[10]SanchezCesedes M, Estller M, Wu L, et al. Gene promoter hypermethylaton in tumors and serum of head an neck cancer patiens[J]. Cancer Res, 2000, 60(4): 892895.
[11]Esteller M, Herman JG. Generating mutations but providing chemosensitivity: the role of O6methylguanine DNA methyltransferase in human cancer. Oncogene, 2004 , 23(1):18.