vWF和HDAC1在胃癌细胞株BGC823中的表达及对细胞粘附侵袭迁移能力的影响

vWF和HDAC1在胃癌细胞株BGC823中的表达及对细胞粘附侵袭迁移能力的影响作者：王敏，刘伟，杨爱军，王晨昱，李敏    作者单位：兰州大学基础医学院病理学研究所，甘肃 兰州 730000    【摘要】  目的：研究血管性血友病因子（vWF）及组蛋白去乙酰化酶1（HDAC1）在人胃癌细胞株BGC823中的表达及对细胞粘附、侵袭、迁移能力的影响，并探讨其机制. 方法：体外培养人胃癌细胞株BGC823，分别以vWF抗体（vWF Ab）及HDAC1抗体(HDAC1 Ab)作用处理；用RTPCR和免疫细胞化学方法检测细胞中vWF和HDAC1的表达及相互作用. 噻唑兰比色（MTT）法检测对细胞外基质成分Ⅳ型胶原粘附能力的变化；Boyden小室法检测细胞侵袭、迁移能力的改变. 结果：BGC823细胞能够表达vWF和HDAC1；经HDAC1 Ab处理后，细胞中vWF mRNA相对含量由处理前的0.2134增加到0.3214，vWF蛋白表达增强；vWF Ab处理组细胞的粘附率较未处理组明显下降（P<0.01）；vWF Ab处理组细胞侵袭、迁移穿膜细胞数分别为54.86±9.94和60.47±16.20，与空白对照组相比较差异具有统计学意义（P<0.01）. 结论：人胃癌细胞株BGC823能够表达vWF 及HADC1；HDAC1可调节vWF的表达；vWF在 BGC823细胞的粘附、侵袭及迁移过程中起重要促进作用.    【关键词】  胃肿瘤；细胞系，肿瘤；von willebrand因子；组蛋白去乙酰化酶1；肿瘤转移　　Expressions of vWF and HDAC1 and their effects on adhesion, invasion and motility in human gastric cancer cell line BGC823 in vitro　　WANG Min, LIU Wei, YANG AiJun, WANG ChenYu, LI Min  Institute of Pathology, School of Basic Medicine, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China　　【Abstract】  AIM: To investigate the expressions and effects on adhesion, invasion and motility of von Willebrand factor (vWF) and histone deacetylase 1 (HDAC1) in human gastric cancer cell line BGC823 in vitro and the related mechanism of antimetastasis.  METHODS: Human gastric cancer cell line BGC823 cultured in vitro were treated respectively with vWF antibody (vWF Ab) and HDAC1 antibody (HDAC1 Ab). The expressions of vWF and HDAC1 in BGC823 were detected by RTPCR and immunocytochemistry. The effects of vWF and HDAC1 on the adhesion, invasion and motility of human gastric cancer cell line BGC823 in vitro were explored respectively by MTT colorimetric assay and Boyden chamber.  RESULTS: The human gastric cancer cell line BGC823 expressed vWF and HDAC1. After treatment with HDAC1 antibody, the expression level of vWF mRNA in BGC823 was increased from about 0.2134 to 0.3214, and the expression of vWF protein was increased. Compared with the control group, the adhesion, invasion (54.86±9.94) and motility (60.47±16.20) abilities of the BGC823 cells were decreased significantly (P<0.01) after treatment with vWF antibody.  CONCLUSION: Human gastric cancer cell line BGC823 can express vWF and HDAC1, and the expression of vWF can be regulated by HDAC1. vWF takes an important part in the adhesion, invasion and motility of the BGC823 cells.　　【Keywords】  stomach neoplasms; cell line, tumor; vWF; HDAC1; neoplasm metastasis0  引言    血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）生理状态下参与凝血的发生，但目前临床研究报道其与结肠癌［1］、骨肉瘤［2］和恶性黑色素瘤［3］等肿瘤的转移也有密切关系. 组蛋白去乙酰化酶1（histone deacetylase，HDAC1）作为调控基因的关键酶，参与了vWF的转录调节［4］，其功能异常也被证实与恶性肿瘤的发生和发展有关［5］. 截至目前，关于vWF和HDAC1对胃癌细胞转移能力影响的体外研究尚少见报道. 我们以胃癌细胞BGC823为研究对象，采用vWF抗体及HDAC1抗体进行体外干预，观察vWF和HDAC1的表达、相互作用和对细胞粘附、侵袭、迁移能力的影响，并初步探讨其作用机制.1  材料和方法　　1.1  材料  RPMI1640（美国Gibco公司）；胰酶(美国Amresco公司)；超级新生牛血清（FBS）（杭州四季青生物工程有限公司）；Ⅳ型胶原（兰州大学病理研究所自制）；四甲基偶氮唑蓝（MTT）及牛血清白蛋白（BSA）（美国Sigma公司）；兔抗人vWF多克隆抗体（Ab6994，英国Abcam公司）；兔抗人HDAC1多克隆抗体（BA0914）及SP免疫组化试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）；Trizol试剂、RTPCR两步法试剂盒及焦碳酸二乙酯(DEPC)（上海生物工程有限公司）；目的基因、内参引物及Marker（D512A）（TakaRa）；博伊登(Boyden)小室与多聚碳酸酯膜(8.0 μm孔径)（美国Millipore公司）；人胃癌细胞株BGC823（中国科学院上海细胞生物研究所）.　　1.2  方法　　1.2.1  细胞培养  用含100 mL/L灭活新生牛血清的RPMI1640培养液（含105 U/L青霉素、100 mg/L链霉素）在37℃ 50 mL/L CO2及饱和湿度的培养箱中维持培养.　　1.2.2  SP法免疫细胞化学染色  取对数生长期BGC823细胞，消化离心后，将细胞悬液加入已预置无菌小玻片的12 孔板中，每孔含细胞2×104个，培养36 h后，取出盖玻片，PBS 洗3次，4℃无水乙醇固定. 免疫组化参照试剂说明书进行，苏木精轻度复染，脱水透明，显微镜下观察结果. PBS代替一抗做阴性对照. 判断标准：HDAC1以细胞核呈清晰棕黄色颗粒为阳性细胞，vWF以细胞浆出现棕黄色颗粒为阳性细胞.　　1.2.3  RTPCR　　1.2.3.1  细胞处理  实验分为对照组：无任何干预，细胞在37℃ 50 mL/L CO2条件下培养 48 h后检测vWF mRNA及HDAC1 mRNA表达；vWF Ab处理组：用20 μg/mL vWF Ab作用细胞 48 h后，检测HDAC1 mRNA表达；HDAC1 Ab处理组：用10 μg/mL HDAC1 Ab作用细胞 48 h后，检测vWF mRNA表达.　　1.2.3.2  两步法RTPCR  用 Trizol试剂提取细胞总RNA，参照AMV第一链cDNA合成试剂盒说明书操作合成cDNA，以OligodT为引物反转录，vWF及HDAC1特异引物进行PCR扩增，vWF的引物序列为，上游5′ ATAGGAGCACACCCCTTGC 3′，下游5′ CACTTTGTCGCCCATTATCC 3′，大小为141 bp；HDAC1的引物序列为，上游5′ CTCTCCAGCTCTGGCTTCC 3′，下游5′ AGACCTGGCACCCTTTATGG 3′, 大小为234 bp；以GAPDH为内参照，引物序列为，上游5′ TTCTCCCCATTCCGTCTTCC3′，下游5′ GTACATGGTATTCACCACCC 3′，大小为456 bp. 反应条件：vWF及GAPDH条件一致：94℃变性 4 min, 94℃ 30 s, 52℃ 40 s, 72℃ 50 s,共循环36次后72℃延伸5 min；HDAC1为94℃变性4 min, 94℃ 30 s, 54℃ 40 s, 72℃ 50 s，共循环45次后72℃延伸5 min. 扩增产物进行1.5 g/L琼脂糖凝胶电泳，电泳图像经凝胶成像扫描仪分析，比较vWF和HDAC1相对表达量.　　1.2.4  粘附抗体抑制实验  分别将20 μg/mL vWF Ab和10 μg/mL HDAC1 Ab加入RPMI1640培养基中，与BGC823细胞共培养48 h；将96孔板预先用3 g／mL Ⅳ型胶原20 μL／孔包被，20 mL/L BSA封板处理，加入调好的细胞悬液200 μL／孔（5×105个／mL）；CO2培养箱分别孵育30，60，90和120 min后，弃去培养液，PBS冲洗除去未粘附细胞；弃PBS后加入MTT 20 μL，及无血清RPMI1640 200 μL，CO2孵育3 h；吸弃培养孔内上清液，加入二甲基亚砜（DMSO） 200 μL溶解，噻唑兰显色，酶联免疫检测仪570 nm处测各孔吸光度（A570 nm）值，同时设立相应的RPMI1640培养对照组. 各组重复3次.　　1.2.5  体外侵袭抑制实验  分别将 20 μg/mL vWF Ab, 10 μg/mL HDAC1 Ab和vWF Ab及HDAC1 Ab混合液加于无血清RPMI1640培养基中，与BGC823细胞共培养 48 h，对照组不做抗体处理；在Boyden小室的下室加入含有 500 mL/L FBS的培养液200 μL，上下室之间用孔径8 μm的聚碳酸酯膜分开，膜上均匀铺浓度为3 g／mL 的Ⅳ型胶原50 μL／室，将小室置于37℃温箱中聚合30 min. 上室内加入预处理的细胞悬液200 μL／室（含2×105个细胞），37℃ 50 mL/L CO2条件下放置48 h. 弃上室液体，用棉签擦掉膜上未侵袭细胞及胶，PBS洗3次，950 mL/L乙醇固定15 min，常规HE染色. 结果判定：在400倍光镜下每个滤膜分别计数5个视野的穿膜细胞数，计算平均每个视野的细胞数. 实验组和对照组重复3次. 按下式计算抗体作用对细胞侵袭的抑制率(IR): IR(%)=(1-实验组平均侵袭细胞数/对照组平均侵袭细胞数)×100%.　　1.2.6  体外迁移抑制实验  细胞处理同侵袭实验，聚碳酸酯膜表面不铺胶，其余步骤同侵袭实验. 通过计数穿膜细胞数反映vWF及HDAC1对BGC823细胞体外迁移能力的影响. 按下式计算抗体作用对细胞迁移的抑制率(IR): IR (%)=(1-实验组平均迁移细胞数/对照组平均迁移细胞数)×100%.    统计学处理：采用SPSS 11.5统计软件进行分析. 计量资料以x±s表示，组间差异比较采用方差分析，两两组间多重比较采用LSDt检验，P<0.05为差异具有统计学意义.2  结果　　2.1  vWF和HDAC1蛋白的表达及相互影响  免疫组化染色结果显示：HDAC1蛋白阳性表达呈深棕色颗粒，主要位于细胞核，呈强表达，胞浆也有少量表达（图1A）；经20 μg/mL vWF Ab处理48 h后，表达无明显变化. vWF蛋白阳性表达呈浅棕色颗粒，位于细胞浆，表达较弱（图1B）；经10 μg/mL HDAC1 Ab处理48 h后，vWF蛋白表达增强，阳性细胞数增多（图1C）.　　A: HDAC1; B: vWF; C:  处理后vWF.　　图1  vWF和HDAC1在胃癌细胞BGC823中的表达  SP  ×400（略）　　2.2  vWF和HDAC1 mRNA的表达及相互影响  RTPCR结果显示: vWF mRNA在BGC823细胞中相对表达值为0.2134；HDAC1 Ab处理细胞后vWF mRNA水平增高，相对值为0.3214；HDAC1 mRNA在BGC823细胞中相对表达值为0.8992， vWF Ab处理细胞后其表达水平与处理前相比较无明显改变， 相对值为0.8790（图2）.　　1～4：GADPH分别对应为6～9的内参；5：D512A  marker；6：空白组HDAC1；7：HDAC1 Ab处理组；8：vWF Ab处理组；9：空白组vWF.　　图2  胃癌细胞BGC823中vWF mRNA及HDAC1 mRNA的表达（略）　　2.3  vWF Ab和HDAC1 Ab对BGC823细胞与细胞外基质成分粘附能力的影响  经vWF Ab和HDAC1 Ab分别作用细胞48 h后，随着时间延长，BGC823细胞在Ⅳ型胶原上的粘附增加；vWF Ab处理组细胞与对照组比较，在各时间点上粘附明显下降，差异有统计学意义（P<0.01）；HDAC1 Ab处理组细胞与对照组比较无明显变化（表1）.　　2.4  vWF Ab和HDAC1 Ab单独及联合作用对BGC823细胞体外侵袭、迁移能力的影响  Boyden小室实验结果显示：vWF Ab处理组侵袭穿膜细胞数为54.86±9.94，迁移穿膜细胞数为60.47±16.20，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01）；HDAC1 Ab处理组和协同处理组分别与对照组比较，侵袭、迁移穿膜细胞数差异无统计学意义(P>0.05, 表2，图3）.　　表1  vWF Ab和HDAC1 Ab对BGC823细胞与Ⅳ型胶原粘附能力的影响(A570 nm值)（略）　　aP<0.05, bP<0.01 vs对照.　　表2  vWF Ab和HDAC1 Ab单独及联合作用对BGC823细胞侵袭、迁移能力的影响（略）　　bP<0.01 vs对照;  dP<0.01 vs其他处理.　　A: 对照组; B: vWF Ab处理组.　　图3  侵袭实验穿膜细胞  HE ×100（略）3  讨论    目前vWF在恶性肿瘤转移中的作用仍存在争议. 有研究表明发生转移的结肠癌患者血浆vWF水平增高［1］，提示vWF能够促进转移的发生. Terraube等［3］研究发现对于vWF基因缺陷荷瘤小鼠，恶性黑色素瘤的转移潜能增加，揭示vWF有抑制肿瘤转移的作用, 表明vWF在不同的肿瘤中可能分别发挥促进或抑制转移的作用. 本实验探讨了vWF在胃癌细胞体外转移中的作用, 结果表明, 人胃癌细胞BGC823可以产生少量vWF，说明vWF除了由血管内皮细胞和巨核细胞合成外，亦可由肿瘤细胞自身分泌产生；用抗vWF抗体阻抗vWF作用后，BGC823细胞与细胞外基质的主要组成成分－Ⅳ型胶原的粘附能力以及体外的侵袭、迁移能力相应降低. 可能的机制是：肿瘤细胞自身产生的部分vWF，与肿瘤细胞直接粘附，或与肿瘤细胞表面相关粘附分子粘附，通过其“桥梁”作用，促进肿瘤细胞与细胞外基质相粘附，进而改变侵袭、迁移相关性质，提高了肿瘤细胞侵袭、迁移能力. 此外，实验结果还表明，随着时间的延长，细胞的粘附增加，表明肿瘤细胞与细胞外基质的粘附呈时间依赖性.    大量研究［6］证实，组蛋白异常去乙酰化与恶性肿瘤的发生有关. HDAC1作为调控基因的蛋白酶，具有抑制基因转录的作用，在细胞周期进展和分化中发挥重要的作用，参与vWF的转录调节过程［4］，并在多种肺癌细胞系中高表达［7］. 我们研究结果表明BGC823细胞能表达HDAC1，但其对于肿瘤细胞粘附、侵袭迁移能力无明显直接影响. 我们用抗HDAC1抗体阻抗HDAC1作用，诱导组蛋白高乙酰化后，结果显示vWF mRNA及蛋白质水平相对增高，提示 HDAC1作为vWF的作用因子之一，能部分调节vWF的表达. 同时，观察到两者的联合作用对细胞侵袭、迁移能力的影响与未处理组比较无明显差异，可能由于封闭HDAC1作用后增加了vWF的表达，同时加入的vWF抗体抵消了相应的效应，具体的作用机制，还需要进一步研究.    综上所述，本实验证实了人胃癌细胞株BGC823能够产生少量vWF；HDAC1可对 vWF的表达进行调节；vWF能够增加肿瘤细胞的粘附、侵袭迁移能力，在肿瘤转移中发挥重要作用.【参考文献】  　［1］ Wei SW, Jen KL, Tzu CL, et al. Plasma von Willebrand factor level as a prognostic indicator of patients with metastatic colorectal carcinoma［J］. World J Gastroenterol, 2005,11(14):2166-2170.　　［2］ Eppert K, Jay S, Aneliunas V, et al. von Willebrand factor expression in osteosarcoma metastasis［J］. Mod Pathol, 2005,18:388-397.　　［3］ Terraube V, Pendu R, Baruch D, et al. Increased metastatic potential of tumor cells in von Willebrand factordeficient mice［J］. Thromb Haemost, 2006, 4: 519-526.　　［4］ Yi WP, Nadia J. The NFY transcription factor inhibits von Willebrand factor promoter activation in nonendothelial cells through recruitment of histone deacetylases［J］. J Biol Chem, 2003, 278(10): 8385-8394.　　［5］ Jing YF, Zhang ZX, Xu YJ, et al. Histone deacetylase inhibitors, anti cancerous mechanism and therapy for gastrointestinal cancers［J］. J Gastroenterol Hepatol, 2005, 20: 988-994.　　［6］ 刘春艳,孙海晶,陆 军,等. 组蛋白乙酰化与癌症［J］. 生物化学与生物物理进展, 2003,30(1):19-23.　　［7］ Sasaki H, Moriyama S, Nakashima Y, et al. Histone deacetylase 1 mRNA expression in lung cancer［J］. Lung Cancer, 2004, 46: 171-178.