涎腺腺样囊性癌转移细胞株的Notch基因表达

作者：卢友光, 杨春桃, 丁林灿, 佘 林

作者单位：福建医科大学 附属口腔医院, 福州 350002

    【摘要】  目的 筛选与涎腺腺样囊性癌转移相关的候选基因,并对其进行初步验证。 方法 限制片段差异显示PCR技术(RFDD-PCR)构建涎腺腺样囊性癌高低转移细胞株(ACC-M、ACC-2)基因表达谱,生物信息学分析两个表达谱的Notch基因,半定量RT-PCR技术对两细胞株的Notch基因差异表达进行验证。 结果 用RFDD-PCR方法成功构建涎腺腺样囊性癌高低转移细胞株(ACC-M、ACC-2)的表达谱,共获得5 420个基因片段,其中包含3个Notch基因。半定量RT-PCR证实Notch2、Notch4在ACC-M的表达高于ACC-2,Notch1在两表达谱未见表达,半定量RT-PCR发现其在ACC-M的表达高于ACC-2。Notch3在两个细胞株表达的差别无统计学意义。 结论 Notch1、Notch2、Notch4可能与涎腺腺样囊性癌的发生、发展、转移有关。

【关键词】  癌,腺样囊性; 涎腺肿瘤; 基因表达谱; 逆转录聚合酶链反应; 基因

     Differential Expression of Notch Genes

    in Different Metastasis Potential Adenoid Cystic Carcinoma

    LU Youguang, YANG Chuntao, DING Lincan, SHE Lin

    The Affiliated Somatological Hospital, Fujian Medical University, Fuzhou 350002, China

    ABSTRACT:  Objective  To screen candidate genes related to cancerometastasis and adenoid cystic carcinoma.  Methods  Restriction fragments differential display PCR(RFDD-PCR) was used to set up gene expression profiles of adenoid cystic carcinoma cell lines-ACC-M and ACC-2 with high and low metastasis potential respectively.  Candidate genes were screened through bioinformatics analysis.  The expression of 4 genes of Notch family was assessed by semi-quantitative RT-PCR.  Results  Two gene expression profiles including 5 420 gene fragments were constructed, 3 genes of Notch family were observed in these two cell lines.  Semi-quantitative RT-PCR identified that 3 gene of Notch were Notch1, Notch2, and Notch4.  Conclusion  Notch1, Notch2, Notch4 may be related to carcinogenesis and metastasis of adenoid cystic carcinoma.

    KEY WORDS:  carcinoma,adenoid cystic; salivary gland neoplasms; gene expression profiling; reverse transcriptase polymerase china reaction; genes

    恶性肿瘤的浸润、转移是一个多因素、多步骤、多基因参与的复杂过程,也是恶性肿瘤患者主要致死原因。近年来研究发现,Notch基因改变与肿瘤、遗传性疾病、神经退行性疾病、心血管病变等多种疾病的发生发展有密切关系。笔者从基因组的整体水平,观察Notch基因在涎腺腺样囊性癌高低转移细胞株间mRNA表达的差异,为临床寻找更为敏感的转移相关指标提供参考。

    1  材料和方法

    1.1  材料

    1.1.1  细胞与试剂  人涎腺腺样囊性癌高转移细胞株(ACC-M)和低转移细胞株(ACC-2)由上海第九人民医院口外肿瘤实验室惠赠。Trizol试剂(美国 Invitrogen公司);第2代差异显示试剂盒/DISPLA YPROFILETM Kits(美国Q-biogene公司);Cy5荧光标记试剂盒(英国Amersham Biosciences公司);Rnase抑制剂、逆转录酶(美国Promaga公司);Taq DNA聚合酶、DL-2000 DNA Marker［中国宝生物工程(大连)有限公司］;Notch等引物(上海中科开瑞生物芯片科技股份有限公司合成)。

  1.1.2  主要仪器  紫外可见分光光度计(美国Bio-Rad公司);Mastercycler Gradient 5331 PCR仪(德国Eppendorf公司);Typhoon9200荧光成像系统(英国Amersham Biosciences公司);高压垂直电泳系统(美国Bio-Rad公司);GeneSnap凝胶成像系统(英国SynGene公司)。

    1.1.3  生物信息学工具  http://www.Qbio-gene.com/displayfit/数据库;GeneBank数据库;IMAGETOOL软件;Imagequant软件(Amersham Biosciences,v2003.02);GeneTools软件(SynGene,Version 3.00.22);SAS软件等。

    1.2  方法

    1.2.1  表达谱构建  Trizol试剂提取ACC-2、ACC-M的总RNA;根据两样品浓度不同取相应体积的总RNA(相当于1 μg),以随机锚定引物5’T25V合成cDNA;利用TaqI限制性内切酶位点一般位于编码区外的特性,将两样品cDNA用TaqI限制性内切酶进行消化,与两种特殊设计的接头混合相连;以64种差异显示引物分别对2种细胞株的转录组片段进行扩增;引物的特殊设计可以使扩增产物覆盖所有转录组片段,引物以Cy5荧光标记;采用6%尿素变性聚丙烯酰胺电泳分离、显示各转录组片段,在荧光成像系统上扫描凝胶,获得表达谱电泳图像［1］。

    1.2.2  表达谱生物信息学分析  图像分析软件测量出所有片段在凝胶上的迁移距离。SAS统计软件进行曲线拟合,找出最佳拟合曲线,计算各片段bp值。以片断大小和所在“表达窗”作参数,按2%容许误差从数据库（Qbio-gene Inc.& MPBiomedicals Inc公司提供）确定其所对应的基因,每个片段数据均与NCBI GeneBank直接链接。

    1.2.3  Notch基因表达  确定筛选出的Notch各基因在表达谱的位置及大小(bp),比较其在2个基因表达谱间的表达差异。

    1.2.4  半定量RT-PCR验证Notch基因的差异表达  Trizol试剂提取涎腺腺样囊性癌细胞株ACC-2、ACC-M的总RNA;紫外可见分光光度计测定样品D(260 nm)及D(280 nm),根据D(260 nm)将两样品总RNA稀释至相同浓度;各取总RNA用逆转录酶2 μg逆转录为cDNA;等量取cDNA用相对应的引物对Notch的基因片段进行扩增。引物序列及扩增条件见表1。

    PCR循环程序:预变性94 ℃,2 min;变性94 ℃,30 s,退火温度见表1,时间30 s,延伸72 ℃,30 s,循环次数见表1;72 ℃,10 min结束反应。1.5％琼脂糖凝胶电泳分离片段。电泳后凝胶条带经GeneSnap成像后用GeneTools进行半定量分析,结果用各个基因扩增条带的灰度值与内参照β-actin的灰度值的比值表示。所有RT-PCR均行3次试验,两个细胞株Notch基因RT-PCR与内参相对信号强度的比值用均数方差分析。

    2  结  果

    2.1  表达谱  电泳结果:条带大小集中在50～1 000 bp,条带间界线清晰,分离效果好,两细胞株共获得有意义条带5 420条,达到表达谱要求。3个Notch基因中Notch2、Notch4在ACC-M表达高于ACC-2,Notch3在两细胞株间的表达接近(表2)。 表1  4个Notch基因RT-PCR的条件表2  Notch基因的RFDD-PCR结果

    2.2  Notch基因RT-PCR  半定量RT-PCR结果显示Notch1、Notch2、Notch4在ACC-M中的表达高于ACC-2(图1)。

    2.3  细胞株Notch基因RT-PCR与内参相对信号强度比较  经过统计学分析(n＝3),Notch1、Notch2、Notch4在ACC-M中的表达明显高于ACC-2(P<0.01);Notch3在两细胞株之间的表达差别无统计学意义(P>0.05,图2)。

    3  讨  论

    Notch基因于1919年在果蝇体内发现,该基因的部分功能缺失会在果蝇翅膀的边缘造成缺口(notch),Notch基因由此而得名。1991年,Notch-1在人类的T淋巴母细胞白血病中首先被鉴定出来,表明了Notch信号通路和肿瘤相关［2］。在乳房肿瘤中,Notch基因、Wnt、成纤维细胞生长因子已被认图1  Notch基因及β-actin的RT-PCR结果

Fig 1  Expression of Notch genes using RT-PCR

    图2  半定量RT-PCR结果阳性的Notch基因与内参的相对信号强度的比较

    Fig 2  Expression intensity of Notch genes compared with positive control-β-actin

    为是主要的原始致癌基因,人类的很多肿瘤(如头颈部肿瘤、子宫内膜癌、肾癌、肺癌、乳腺癌、恶性黑色素瘤等)以及血液系统肿瘤(如霍奇金淋巴瘤、B淋巴细胞白血病等)均发现Notch-1受体的异常表达［3］。Santagata等认为Notch的配体JAGGED1与前列腺癌的进展和转移有关［4］。李大卫等使用组织芯片发现，Notch-1在胃癌中的表达与肿瘤的分化程度及浸润深度、脉管浸润明显相关,这可能是因为Notch-1促进NF-κB表达,而后者上调了基质金属蛋白酶MMP-9及血管内皮生长因子VEGF导致的侵袭浸润增强有关［5-6］。Snijders等报道Notch基因的过表达与口腔鳞状细胞癌相关［7］。Leethanakul等认为Notch可以作为头颈部鳞状细胞癌癌前病变诊断的候选基因和治疗新的靶基因［8］。

    涎腺腺样囊性癌高转移细胞株ACC-M是ACC-2经体外和裸鼠体内连续传代培养分离出的高转移细胞株,其中ACC-M转移率为96%,ACC-2转移率为18%［9］。本研究采用第二代差异显示技术RFDD-PCR构建具有相同遗传背景的涎腺腺样囊性癌高转移细胞株（ACC-M）和低转移细胞株（ACC-2）基因表达谱,通过对表达谱的基因进行生物信息学分析,筛选出大量有差异的候选基因,其中包含Notch基因的表达差异。用半定量RT-PCR方法对涎腺腺样囊性癌高低转移细胞株ACC-M、ACC-2的Notch基因进一步研究,发现两种实验方法的结果基本相同(Notch2、Notch3、Notch4),但也存在一些差异,如RFDD-PCR未发现Notch1基因,而RT-PCR发现它们之间存在差异。同时两种方法的结果也提示,ACC-M细胞株的高转移能力可能与Notch基因的表达有关,有必要进一步研究。

【参考文献】  ［1］ 卢友光,周鸿鹰,丁林灿,等. 涎腺腺样囊性癌高、低转移细胞系基因表达谱及基质金属蛋白酶表达差异［J］. 中华医学遗传学杂志, 2006,23(5):505-510.

［2］ Ellisen L W,Bird J,West D C,et al．TAN-l,the human homolog of the drosophila notch gene,is broken by chromosomal translocations in T lymphoblastic neoplasms［J］．Cell, 1991,66(4):649-661.

［3］ Nickolof B J,Osborne B A,Miele L．Notch signaling as a therapeutic target in cancer:a new approach to the development of cell fate modifying agents［J］. Oncogene, 2003,22(42):6598-6608.

［4］ Santagata S,Demichelis F,Riva A,et al. JAGGED1 expression is associated with prostate cancer metastasis and recurrence［J］. Cancer Res, 2004,64(19):6854-6857.

［5］ 李大卫,吴 晴,彭志海,等. 组织芯片研究Notch1与NF-κB在胃癌中的表达和意义［J］. 肿瘤, 2007,27(6):458-461.

［6］ Wang Z,Banerjee S,Li Y,et al．Down-regulation of notch-1 inhibits invasion by inactivation of nuclear factor-kappaB,vascular endothelial growth factor,and matrix metalloproteinase-9 in pancreatic cancer cells［J］. Cancer Res, 2006,66(5):2778-2784.

［7］ Snijders A M,Schmidt B L,Fridlyand J,et al. Rare amplicons implicate frequent deregulation of cell fate specification pathways in oral squamous cell carcinoma［J］. Oncogene, 2005,24(26):4232-4242.

［8］ Leethanakul C,Patel V,Gillespie J,et al. Distinct pattern of expression of differentiation and growth-related genes in squamous cell carcinomas of the head and neck revealed by the use of laser capture microdissection and cDNA arrays［J］. Oncogene, 2000,19(28):3220-3224.

［9］ 关晓峰,邱蔚六,何荣根,等. 肺高转移性涎腺腺样囊性癌细胞株的筛选［J］. 中华口腔医学杂志, 1996,31(2):74-77.