灵芝多糖对前列腺素E2抑制小鼠脾细胞增殖及IL1α, IL2 mRNA表达的拮抗作用

灵芝多糖对前列腺素E2抑制小鼠脾细胞增殖及IL1α, IL2 mRNA表达的拮抗作用 作者：张群， 雷林生， 余传林， 吴曙光 作者单位：南方医科大学药物研究所，广东广州 【摘要】 【目的】观察灵芝多糖（GLB）对前列腺素E2（PGE2）抑制小鼠脾细胞增殖及IL1α、IL2 mRNA表达的拮抗作用。【方法】采用混合淋巴细胞培养反应作为实验模型，四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测细胞增殖程度，半定量逆转录聚合酶链反应（RTPCR）法检测IL1α及IL2 mRNA的表达水平。【 结果】PGE2连续作用48h后，脾细胞增殖反应受到不同程度的抑制作用，当PGE2浓度在10 μmol/L以上时差异有显著性意义(P＜0.01);固定PGE2的浓度为20 μmol/L，并合用不同浓度的GLB（25、50、100、200mg/L），当GLB为100 mg/L以上浓度时可部分对抗PGE2（20 μmol/L）的抑制作用(P＜0.05);培养8h及12h后，PGE2（20 μmol/L）可抑制IL1α及IL2 mRNA的表达，GLB为100 mg/L以上浓度时可部分对抗PGE2的抑制作用（P＜0.05或P＜0.01）。【结论】灵芝多糖可部分拮抗前列腺素E2对小鼠脾细胞增殖及IL1α和IL2 mRNA表达的抑制作用。 【关键词】 灵芝多糖/药理学； 肿瘤/中药疗法； 肿瘤/免疫学； 细胞培养 灵芝［Ganoderma lucidum (Leyss ex Fr. Karst.)］是灵芝菌科灵芝属真菌。文献报道［1-3］，灵芝多糖（GLB）是灵芝中主要的生物活性成分之一，其主要的药理作用为增强免疫功能和抗肿瘤。目前其抗肿瘤作用的机制尚不清楚。肿瘤逃避免疫监视的机制比较复杂，其中之一是有些肿瘤细胞能直接分泌［4-5］或刺激巨噬细胞［6］分泌前列腺素E2(PGE2)，后者可对免疫系统产生广泛的抑制作用。藉此，肿瘤得以逃避免疫系统的攻击，在体内无限生长。本研究观察了灵芝多糖对PGE2抑制小鼠脾细胞增殖及IL1α和IL2 mRNA表达的影响，探讨灵芝多糖的抗肿瘤免疫学机理。现报道如下。 1 材料与方法 1.1 动物 C57BL/6j及BALB/c小鼠（SPF级），8～10周龄，雌雄兼用，购自南方医科大学实验动物中心，合格证号分别为：2005A044和2005A046。 1.2 药品与试剂 RPMI1640培养基（GIBCO公司产品）；新生牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司产品）；HEPES（MDBio, Inc分装）；四甲基偶氮唑盐（MTT）、焦碳酸二乙酯（DEPC）、前列腺素E2（PGE2）均为Sigma产品；RNAoutTM（深圳市华氏生物技术有限公司产品）；傻瓜逆转录（RT）反应体系［AccuPower RT PreMix， 内含逆转录酶、脱氧核苷三磷酸(dNTPs)、RNA酶抑制剂、缓冲剂等］, 傻瓜聚合酶链反应（PCR）体系（PCR PreMix，内含Tag DNA聚合酶、dNTPs、PCR增强剂、缓冲剂、上样染料及稳定剂）均购自赛百盛公司；Oligo d T 18(TaKaRa产品)；琼脂糖（Biowest Agarose, 上海YITO生物器材企业有限公司分销）；溴化乙锭(EB, 上海博彩生物工程公司产品)；GLB参照文献方法［7］提取，为多糖组分，呈浅棕色，易溶于水，分子量7 000～9 000D。其他化学试剂均为分析纯。 1.3 仪器 311型CO2培养箱（美国Forma Scientific 公司）；AB120型电子分析天平（美国Denver Instrument公司）；连续波长酶标仪（BioRAD公司）；CS15R台式低温高速离心机（Bechman公司）；PTC100TMPCR循环仪（美国MJ Research. Inc.公司）；Power PAL3000电泳仪（BioRAD公司）；凝胶成像分析系统(法国Ets VILBER LOURMAT公司）。 1.4 方法 1.4.1 混合淋巴细胞培养 参照文献［8］进行。 1.4.2 MTT法检测细胞增殖程度 参照文献［8］进行。结果用570nm处的光密度(D570)值表示。 1.4.3 总RNA提取 根据试剂盒说明书所提供的方案按比例缩小进行操作。于96孔板中，每孔加RNAoutTM试剂40μＬ，每组收集10孔裂解液于0.5mＬEppendorf管中，提取总RNA。 1.4.4 逆转录反应 DEPC处理水配制的Oligo dT18 (10 nmol/L)与DEPC处理水配制的总ＲＮＡ （0.1 mg/L）按体积比1∶1混合于Eppendorf管中，70℃孵育5min，４℃冷却２min。吸取上述混合液20μL加入AccuPower RT PreMix 管中，振荡混匀，加石蜡油15μL，1000r/min离心3s，置PCR循环仪中反应。反应参数如下：42℃、60min，94℃、5min。 1.4.5 PCR扩增 PCR引物采用在线软件Primer 3进行设计。小鼠IL1α：上游引物 5’GCATCCTCACAGCAGGATTT3’，下游引物 5’GAATCCAGGGGAAACACTGA3’，PCR扩增产物为354bp。小鼠IL2：上游引物5’AAGCTCTACAGCGGAAGCAC3’，下游引物5’TCATCGAATTGGCACTCAAA3’，PCR扩增产物为348bp。小鼠βactin：上游引物 5’CCAGAGCAAGAGAGGTATCC3’，下游引物 5’GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA3’，PCR扩增产物为216bp。经预实验发现IL1α和IL2 mRNA的表达丰度约为βactin的1/5左右，为了使被检测基因的扩增速率与βactin的扩增速率基本一致，均处于指数扩增范围从而防止平台效应，在进行βactin基因扩增时，将逆转录第1链cDNA 产物稀释5倍，其他条件与被检测基因相同，操作如下：在PCR PreMix 管中加入消毒双蒸水8μL, 被检测基因mRNA逆转录产物2 μL或内参βactin mRNA逆转录产物经5倍稀释后2 μL，相应的上、下游引物各5μL(15pmol)，振荡混匀，加石蜡油15μL，1000r/min 离心3s，置PCR循环仪中反应。反应参数如下： 94℃预变性2.5min, 然后进入以下28个循环：94℃变性45s，57℃退火1min，72℃延伸1.5min。循环完毕，72℃延伸5min。 1.4.6 半定量分析 取被检测基因和βactin RTPCR扩增产物上样于20g/L琼脂糖凝胶（含溴化乙锭0.5g/L）梳孔中，采用0.5倍Tris硼酸电泳缓冲液，在3V/cm电压条件下电泳50min。将凝胶转移至凝胶分析系统暗箱中，在紫外线照射下测定PCR扩增产物的荧光强度(I)值。结果表示为：p=［I检测基因/（Iβactin×5）］×100%。 1.5 统计学方法 采用SPSS10.0统计软件进行统计分析。混合淋巴细胞培养反应数据的显著性差异采用独立样本t检验；PCR半定量数据采用配对样本t检验。 2 结果 2.1 PGE2对混合淋巴细胞培养反应（MLR）抑制作用的造模浓度 将C57BL/6j及BALB/c小鼠脾细胞按体积比1∶1混合作为MLR模型，PGE2连续作用48h后，小鼠脾细胞增殖受到不同程度的抑制作用，浓度在10 μmol/L以上时差异有显著性意义(P＜0.01)。根据表1结果，选择PGE2抑制模型的造模浓度为20 μmol/L。 2.2 GLB拮抗PGE2对MLR中脾细胞增殖的抑制作用 在MLR中，固定PGE2的浓度为20 μmol/L，再加入不同浓度的GLB（200、100、50、25 mg/L），观察GLB对PGE2的拮抗作用。培养48h后，当GLB为100 mg/L以上浓度时可部分对抗PGE2的抑制作用(P＜0.05)，但不能恢复至正常水平，结果见表2。 2.3 GLB对PGE2抑制MLR中脾细胞IL1α mRNA表达的拮抗作用 培养8h后，GLB（200 mg/L）可明显促进IL1α mRNA的表达，而PGE2（20 μmol/L）抑制IL1α mRNA的表达。两者合用，GLB为100、200 mg/L的浓度时均可部分对抗PGE2对IL1α mRNA表达的抑制作用，结果见图1、表3。 2.4 GLB对PGE2抑制MLR中脾细胞IL2 mRNA表达的拮抗作用 培养12h后， GLB（200 mg/L）同样可以促进IL2 mRNA的表达，而PGE2（20μmol/L）产生抑制作用，结果两者合用，GLB（100、200mg/L）也可部分对抗PGE2对IL2 mRNA表达的抑制作用，结果见图2、表4。表1 PGE2对MLR中小鼠脾细胞增殖的抑制作用统计方法：t检验；①P＜0.01，与阴性对照组比较 表2 GLB拮抗PGE2对MLR中脾细胞增殖的抑制作用统计方法：t检验；①P＜0.01,与阴性对照组比较； ②P＜0.05，与PGE2组比较表3 GLB对PGE2抑制MLR中脾细胞IL1αmRNA表达的拮抗作用统计方法：t检验；①P＜0.05，②P＜0.01，与阴性对照组比较；③P＜0.05，④P＜0.01，与PGE2组比较表4 GLB对PGE2抑制MLR中脾细胞IL2 mRNA表达的拮抗作用统计方法：t检验；①P＜0.05，②P＜0.01，与阴性对照组比较；③P＜0.05，与PGE2组比较 3 讨论 肿瘤发生发展的机制十分复杂，其中有些肿瘤能释放出一些可溶性免疫抑制因子，降低宿主免疫力，从而逃避免疫系统的监视。PGE2是众多免疫抑制因子中最重要的一种，合成PGE2的限速酶是环氧化酶2(COX2), 许多良性癌前病变和恶性肿瘤中均有COX2基因的扩增及其蛋白的高表达, 如结直肠腺瘤和腺癌、胃肠上皮化生和胃癌、食管癌、慢性肝炎和肝细胞肿瘤、胰腺癌、口腔黏膜白斑和头颈部肿瘤、腺瘤样不典型增生和非小细胞肺癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、宫颈癌、光化性角化病和皮肤癌、胶质瘤等［9-10］。有些肿瘤除了本身合成和释放PGE2以外，还刺激宿主巨噬细胞产生PGE2［6］。可见，产生PGE2抑制宿主的免疫功能，从而逃避免疫系统的攻击是众多肿瘤得以无限生长的重要机理之一。PGE2对免疫系统的抑制作用广泛而深重，如抑制白介素1（IL1）［11］和白介素2（IL2）［12］的产生等。在特异性免疫反应中，巨噬细胞在呈递抗原的同时，合成和释放IL1，IL1再作用于T辅助细胞产生IL2，后者产生广泛的免疫调节作用，包括促进前体细胞毒T细胞的活化，并分化为具有杀伤活性的效应细胞毒T细胞(Tc)，Tc在肿瘤免疫中发挥重要作用。 混合淋巴细胞培养反应（MLR）是同种异型抗原诱发的特异性免疫反应模型，具有特异性免疫应答的一般特征，实验操作简单、方便，得到的结果具有较好的指导意义。本研究结果显示PGE2可抑制MLR中小鼠脾细胞的增殖，抑制IL1α和IL2 mRNA的表达，这些结果与以往采用其他模型的研究结果相一致［11-12］，说明本研究的模型是可靠的。 灵芝多糖的免疫增强作用和抗肿瘤作用已得到广泛的研究和证实，但其抗肿瘤作用机制尚不十分清楚。本研究发现GLB在100 mg/L以上时可部分对抗PGE2（20 μmol/L）对小鼠脾细胞增殖和IL1α、IL2 mRNA表达的抑制作用(P＜0.05)，提示灵芝多糖对产生PGE2的肿瘤进行辅助治疗具有一定的临床意义，也提示灵芝多糖拮抗PGE2的免疫抑制作用可能是其抗肿瘤作用的免疫学机制之一。 【参考文献】 ［1］Li M C, Liang D S, Xu Z M, et al. 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