乳腺癌细胞中Her2介导p27Kip1高表达的分子机制

乳腺癌细胞中Her2介导p27Kip1高表达的分子机制作者：唐来芹， 管晓翔， 陈龙邦    作者单位：210002 南京军区南京总医院肿瘤内科    【关键词】  肿瘤；肿瘤干细胞；肿瘤治疗    原癌基因Her2也称CerbB2或Her2/neu,是人类表皮生长因子受体（EGFR）家族的第二个成员，位于染色体17q21,编码1 255个氨基酸的具有跨膜酪氨酸激酶活性的生长因子，包括能与配体结合的细胞外功能区和细胞内部的具有酪氨酸激酶活性部分以及跨膜区，受体分子量约为185KD，因此又被称为p185[1]。尽管Her2蛋白受体的确切配体还不清楚，但是特定的配体作用于Her1、Her3、Her4等EGFR家族中的成员后，Her2可以与这些成员形成异二聚体而激活其细胞膜内侧含有酪氨酸残基的蛋白片段，羧基末端的酪氨酸激酶发生磷酸化，Her2的过表达促进肿瘤细胞增殖加快，细胞的恶性度增强[2]。目前已经在25%～30%的乳腺癌、10%～15%卵巢癌、5%～10%的胃癌、结肠癌以及非小细胞肺癌这几种肿瘤细胞中发现Her2过表达。Her2过表达产生的效应主要是促进肿瘤细胞的增殖加快、细胞周期加速、细胞的恶性表现强，并有抗凋亡及对多种化疗药物的耐药现象[3]。    Herceptin以Her 2为靶点的人源化单克隆抗体，成为乳腺癌治疗领域第一个分子靶向性药物，它是一种高纯度重组DNA衍生的人源化的单克隆免疫球蛋白G1（IgG）轻链抗体，能够特异性识别Her2蛋白受体的胞外功能区，抑制其介导的信号传导，起到抗肿瘤作用，对于人表皮生长因子受体2（Her2）阳性的转移性乳腺癌有较好的疗效。尽管Herceptin的临床疗效得到了肯定，但是其抗肿瘤的作用机制目前还有待进一步研究。研究发现p27Kip1可能在Herceptin抑制乳腺癌细胞增殖过程中起到了一定的作用。1  Herceptin对Her2过表达乳腺癌患者的治疗及作用机制            研究发现20%～30%的乳腺癌患者有Her2过表达，Her2过表达预示患者预后不良，对标准化疗和内分泌治疗效果较差。自1998年美国FDA批准Herceptin应用于Her2过表达的转移性乳腺癌治疗以来， 其疗效已经逐渐得到了肯定，单药治疗过表达Her2的转移性乳腺癌的总有效率在25%左右[2]。2005年ASCO会议上已公布辅助化疗后单药使用Herceptin一年，能够延长Her2过表达乳腺癌患者的无病生存时间，降低复发转移的风险，延长生存期，而心脏毒性没有明显提高。    临床研究已经证实，与Herceptin单独应用相比，与铂类（顺铂或卡铂）、紫杉醇、阿霉素联合化疗具有协同作用，能够提高化疗药物的疗效。Herceptin联合化疗能明显提高复发转移乳腺癌的缓解率，延长疾病的进展时间以及患者的无病生存期。Herceptin联合化疗，安全性较好，耐受性高[2,4]。2004年欧洲很多国家就已经把Herceptin联合多西紫杉醇作为Her2过表达的转移性乳腺癌的一线治疗方案。    尽管Herceptin广泛应用于临床已有近十年，然而，Herceptin的抗癌作用机制尚未明确，可能通过以下途径抑制Her2过表达的乳腺癌细胞的生长[5]：(1)与Her2特异性结合，阻断配体介导的细胞信号传递，影响上皮细胞的生长；(2)加速Her2蛋白受体的内化和降解；(3)下调Her2基因发挥抗增殖作用；(4)通过ADCC机制提高免疫细胞攻击和杀伤肿瘤细胞的能力；(5)下调血管内皮生长因子和其他血管生长因子，抑制肿瘤内血管组织的生长；(6)诱导细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂（cyclindependent kinase inhibitor，CDKI）使细胞周期停滞，促进细胞凋亡。目前研究较多的是Herceptin可能诱导抑癌基因p27Kip1达到治疗效果。2  p27Kip1参与Herceptin作用过程    p27Kip1是一种相对分子量为27KD的耐热性细胞周期抑制蛋白，人的p27Kip1基因主要位于第12号染色体短臂1区3 带12p13，含有两个外显子与两个内含子，人的p27Kip1cDNA长594bp，编码198氨基酸。p27Kip1通过抑制cyclinCDK复合物的活性，主要对细胞周期从G1期到S期的转换抑制以阻滞细胞周期的进程，属于细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子。反之，cyclinCDK复合物也能直接下调p27kip1的表达并抑制其活性，促进细胞增殖。如cyclinCDK2能使p27Kip1的Thr187发生磷酸化并引起其在细胞内的降解，使细胞周期从G1期进入S期。    在人乳腺癌患者细胞内中，p27Kip1的表达水平与腋窝淋巴结转移以及患者的无病生存期有显著关系。p27Kip1高表达者腋窝淋巴结转移少或无，无病生存期较长；p27Kip1低表达的患者腋窝淋巴结转移常见，无病生存期较短。以上研究表明细胞内p27Kip1的表达水平是一项有独立预后价值的指标。Nahta R等[2]发现Herceptin能提高细胞内p27Kip11的表达水平以抑制肿瘤细胞的增殖，控制病情的进展，延长患者的生存期。3  Herceptin上调乳腺癌细胞内p27Kip1的表达的作用机制3.1  阻断PI3K/Akt通路    磷脂酰肌醇3 激酶（PI3 K) 在肿瘤细胞信号转导中起着重要的调节作用，肿瘤细胞在一系列内外因素的作用下,通过启动PI3 K/ Akt 信号转导通路诱导细胞的增殖、分化,避免细胞发生凋亡。PI3K/Akt信号传导通路的激活能够导致p27kip1在特定细胞中的表达下调，同时能促进细胞内p27Kip1蛋白水解[6]。    Michael Yakes等[7]研究证实PI3K/Akt信号传导通路的激活作用主要发生在转录后阶段，Akt能磷酸化p27Kip1核定位信号区的第157位苏氨酸和第198位的苏氨酸。在PTEN缺失和Her2过表达的细胞中,Akt介导的磷酸化可抑制p27Kip1的核转位，p27Kip1第198位苏氨酸的磷酸化将促使p27kip1聚集于细胞质中并促进其降解。Akt的活化与乳腺癌患者细胞质内的p27kip1表达水平有很大关系[6]。Herceptin与细胞膜表面的Her2/neu蛋白结合阻断PI3K/Akt通路主要通过抑制Akt磷酸化p27Kip1核定位信号区第157位和第198位苏氨酸来上调细胞内p27Kip1。    3.2  抑制周期素蛋白依赖激酶2(CDK2)    在转录过程中和转录后阶段，p27Kip1都有表达。但是p27Kip1的表达调控主要在转录后阶段，泛素蛋白连接酶SCFSKP2途径是转录后阶段调控p27Kip1表达的主要机制。cyclinECDK2磷酸化修饰p27Kip1第187位苏氨酸，磷酸化的p27kip1与泛素蛋白连接酶SCFSKP2结合使p27Kip1降解[89]。    研究发现Herceptin主要在转录后阶段通过增强p27Kip1蛋白的稳定性以诱导其表达。体外试验已经证实Herceptin与细胞膜表面的Her2/neu蛋白结合，通过阻滞cyclinECDK2磷酸化修饰p27Kip1第187位苏氨酸，降低p27Kip1与泛素蛋白连接酶SCFSKP2的结合以抑制p27Kip1的降解，Herceptin还能延长p27Kip1的半衰期。p27Kip1蛋白在降解前必须首先发生磷酸化，若能阻断其磷酸化就能减少p27Kip1的降解。所以抑制cyclinECDK2的功能是Herceptin控制p27Kip1降解的重要机制。Herceptin阻滞cyclinECDK2磷酸化修饰p27Kip1第187位苏氨酸的途径还需要进一步研究。然而，Dipak Das等[10]最近研究发现 Ras介导的MAPK信号传导通路能够促进p27Kip1表达下调，Her2与其家族中的其他受体酪氨酸激酶Her3、Her4等形成异二聚体，引起Her2羧基末端的酪氨酸残基磷酸化，其下游的信号蛋白如SHC以及Grb2结合到Her2蛋白羧基末端的src同源区。在细胞膜内侧，SOS与SHC及Grb2相互作用，导致SOS激活ras，最终激活MAPK。MAPK的激活可将信号转入细胞核内，活化了很多转录因子cmyc、cfos以及cjun，导致p27Kip1表达下调，p27Kip1表达下调促进细胞的异常增殖、分化。Herceptin与细胞膜表面的Her2蛋白结合阻断Ras介导的MAPK信号传导通路能够上调细胞内p27Kip1从而抑制细胞的异常增殖。总之，Herceptin同时具有抑制cyclinECDK2的功能和阻断Ras介导的MAPK信号传导通路的作用来上调抑癌基因p27Kip1表达。    3.3  抑制核转运蛋白Jab1/CNS5    J.Esteva等[11]研究发现在人乳腺癌细胞中核转运蛋白Jab1比正常乳腺上皮细胞中表达量高，而p27Kip1表达量降低。核转运蛋白Jab1能诱导p27Kip1降解以促进肿瘤细胞增殖，它主要诱导p27Kip1从细胞核内转运至细胞质中，并且通过泛素蛋白连接酶加速p27Kip1在细胞质中的降解。除了Jab1/CSN5能够诱导p27kip1降解，CSN3、CSN6、CSN7与CSN8的过表达也能够诱导p27Kip1在细胞质中的降解。Jab1/CSN5能够调节p27Kip1在细胞中的穿梭运动以及其他CSN的功能，它们是诱导p27Kip1在细胞质中降解的重要途径。Herceptin与细胞膜表面的Her2蛋白结合，降低了乳腺癌细胞内核转运蛋白Jab1的表达；Jab1表达下降，p27kip1从细胞核内转运至细胞质中的量将减少，在细胞核内聚结增多，最终抑制肿瘤细胞增殖。现发现第10位丝氨酸磷酸化的p27Kip1也能够降低核转运蛋白Jab1的表达，这与Herceptin能够提高p27Kip1第10位丝氨酸磷酸化，进一步降低核转运蛋白Jab1的表达相一致。    有研究证明p27Kip1蛋白能与核内蛋白相互作用[11]。Nup50/NPAP60在p27Kip1转运至核内发挥重要的作用。两种核转运蛋白CRM1与rasGTP激酶Ran在细胞质与细胞核之间转运。第10位丝氨酸磷酸化的p27Kip1蛋白与核转运蛋白CRM1结合后才能够从细胞核内转运至细胞质中。在观察Herceptin对Nup50/NPAP60的作用效果时，研究者们利用RTPCR检测实验结果发现Herceptin并没有改变Nup50/NPAP60、核转运蛋白CRM1以及Ran的表达。因此，Herceptin除了作用于核转运蛋白Jab1/CSN5之外，对其他的核转运蛋白不起作用。    3.4  抑制核蛋白hKIS的功能    p27Kip1第187位苏氨酸的磷酸化能够加速p27Kip1的降解；而第10位丝氨酸的磷酸化能够增强p27Kip1蛋白的稳定性。所有p27Kip1磷酸化中，有75%都发生了第10位丝氨酸的磷酸化，这说明第10位丝氨酸的磷酸化是其主要的磷酸化位点。Ishida等[12]研究证实核蛋白hKIS能够磷酸化p27Kip1的第10位丝氨酸，但是核蛋白hKIS磷酸化p27Kip1的第10位丝氨酸不是增强p27Kip1的稳定性，而促进其从细胞核转运至细胞质中，这一发现说明:①核蛋白hKIS催化第10位丝氨酸的磷酸化能够促进抑癌基因p27Kip1的降解，减少p27Kip1在细胞内的含量，促进肿瘤细胞的增殖；②核蛋白hKIS的过度表达能够拮抗p27Kip1的生物学功能，使细胞异常增殖、分化。当细胞内核蛋白hKIS缺失时，p27Kip1第10位丝氨酸不能发生磷酸化，但能够抑制细胞的增殖。体外实验研究已经证实Herceptin与细胞膜表面的Her2/neu蛋白结合，能够减少细胞内核蛋白hKIS的表达，从而减少hKIS磷酸化p27Kip1的第10位丝氨酸，提高p27Kip1在细胞核内的含量；也能通过调节hKIS抑制p27Kip1从细胞核内移至细胞质，避免其在细胞质中的降解，能在细胞核内发挥其生物学效应[13]。    3.5  上调MIRK/DYRK1B    p27Kip1 第10位丝氨酸的磷酸化是最主要的磷酸化位点，约占p27Kip1总磷酸化位点的75%左右，这与有两种不同的磷酸化酶作用于第10位点有关。Deng X等[14]研究发现MIRK、DYRK1B能够磷酸化p27Kip1蛋白第10位丝氨酸。与核蛋白hKIS催化第10位丝氨酸的磷酸化促进p27Kip1从细胞核内移至细胞质中降解不同，MIRK、DYRK1B磷酸化p27Kip1蛋白第10位丝氨酸能够增强p27Kip1蛋白的稳定性，不是诱导p27kip1从细胞核内移至细胞质中降解。MIRK的缺失或降低，p27Kip1蛋白的稳定性也下降。生长刺激因子能够减低MIRK的表达。MIRK还可能通过其他作用机制调节细胞周期的改变，Zou X等[15]研究发现MIRK也能与细胞周期素D1结合，并且促进第288位苏氨酸发生磷酸化，使细胞周期素D1降解、细胞周期停滞，减少肿瘤细胞的异常增殖、分化。    调节p27Kip1蛋白第10位丝氨酸的磷酸化的过程中，MIRK和hKIS的作用截然相反[14]。①丝裂原能够激活hKIS，但是不能激活MIRK。②MIRK表达水平和活性在细胞周期的G0期最高，在G1期降解；而hKIS表达水平和活性在G1期逐渐上升。③hKIS催化第10位丝氨酸的磷酸化促进抑癌基因p27Kip1从细胞核内移至细胞质中降解，而MIRK磷酸化p27Kip1蛋白第10位丝氨酸能够增强p27Kip1蛋白的稳定性。除了上述作用不同外，MIRK和hKIS可能还有其他不同的作用。Herceptin与细胞膜表面的Her2/neu蛋白结合促进细胞内MIRK的表达，这一结论也证明Herceptin能够提高p27Kip1的第10位丝氨酸的磷酸化。通过抑制hKIS和激活MIRK，Herceptin诱导p27kip1的第10位丝氨酸的磷酸化阻止其核外运，并且能够增强核内p27Kip1蛋白的稳定性。    3.6  抑制细胞周期素CDK和癌基因cmyc的表达    抑癌基因p27Kip1是一个非特异的CDKI，可抑制许多不同的CDK复合物，但是主要抑制周期素ECDK2和周期素DCDK2等G1期激酶复合物。研究表明cyclinECDK2与cyclinDCDK2是细胞周期中催化细胞由G1期进入S期的关键酶，p27Kip1蛋白主要通过对折良种复合物的抑制使细胞停滞于G1期，从而实现对细胞周期调控功能。p27Kip1对CDK的抑制有两个方面：①能够抑制已激活的周期素CDK的激酶活性；②也能够抑制CDK的激活过程[4，7]。    Suldan等[16]研究发现癌基因cmyc也能够抑制p27Kip1的活性。cmyc表达增强可防止周期素ECDK2活性的灭活，允许细胞在p27Kip1存在的情况下继续增殖，cmyc在此过程中，既没有改变周期素ECDK2对p27Kip1抑制作用的易感性，还只会诱导p27Kip1以一种不能与周期素ECDK2结合的形式存在，积聚在细胞内。癌基因cmyc能够在转录水平通过激活泛素蛋白连接酶SCFSKP2，抑制p27Kip1的功能同时促进其降解，癌基因cmyc与Ras在细胞内的共同表达可使细胞内抑癌基因p27Kip1消失。O’Hagan等[17]研究发现Her2的信号传导过程中通过激活RasMAPK通路，能促进细胞周期素D和癌基因cmyc的表达，从而促进细胞内的p27Kip1降解。阻断RasMAPK通路，细胞周期素D和癌基因cmyc的表达将下调。Her2的过表达能够通过激活RasMAPK（ERK、cJun、JNK、p38）通路增强细胞周期素D的活性。    已有研究证明Herceptin能够同时抑制细胞周期素D和癌基因cmyc的表达。Herceptin与细胞膜表面的Her2/neu蛋白结合发挥药效时首先抑制癌基因cmyc的表达，然后再抑制细胞周期素D的表达，抑制细胞周期素D表达的过程较慢。总之，Herceptin能够抑制细胞周期素D和癌基因cmyc的表达以上调细胞内的p27Kip1 ，同时也能够抑制p27Kip1与CyclinECDK2复合物结合。4  结语    国内外学者对于Herceptin的作用机制已做了很多的研究，但是确切的机制还有待进一步探讨。近来Herceptin上调过表达Her2的乳腺癌细胞内p27Kip1的作用机制成为研究热点。已发现Herceptin可能通过上述几种不同的途径最大限度提高细胞内p27Kip1的表达，达到抑制肿瘤细胞增殖、分化的目的。因此，这一发现让人们对Herceptin的作用机制有更进一步的了解，同时它的应用为HER2 阳性乳腺癌患者的治疗也提供了更多的选择。【参考文献】  ［1］ Pegram M,Ngo D．Application and potential limitations of animal models utilized in the development of 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