人肝癌细胞感染蓝舌病毒HbC3株超微结构的动态观察

【摘要】  目的 探讨蓝舌病毒靶向抗肿瘤的细胞生物学机制。方法 利用透射电镜观察蓝舌病毒HbC3株感染人肝癌细胞Hep3B的形态发生学以及该病毒引起的细胞的病理改变。结果 BTVHbC3以受体介导的胞饮作用穿入细胞，溶酶体水解病毒外衣壳，使之成为亚病毒粒子，胞浆内有病毒包涵体及未装配成熟的亚病毒颗粒。随后亚病毒颗粒装配上外层蛋白结构，形成成熟的病毒粒子。病毒感染细胞12～18h时，细胞以挤出的方式释放病毒并达到高峰。18～48h时，病毒进入超感染期, 大量细胞发生病变, 出现细胞凋亡和溶解。结论 一旦蓝舌病毒感染Hep3B肿瘤细胞即可在细胞内增殖并诱导该肿瘤细胞进入凋亡，死亡的肿瘤细胞释放出的病毒粒子并再次感染其他肿瘤细胞，直至将全部肿瘤细胞杀灭，其溶瘤方式为链式反应。

【关键词】  蓝舌病毒HbC3（BTVHbC3） 人肝癌细胞（Hep3B） 形态发生学 溶癌病毒

　　0  引言    　　癌的治疗问题至今尚未得到有效解决的重要原因之一是现有治疗手段缺乏靶向性。我们在长期的病毒与癌的研究过程中发现：不感染人正常细胞的蓝舌病毒HbC3株(Bluetongue  VirusHb  C3 strain,BTVHbC3)却能有效地杀死某些人和动物肿瘤[1,2]。BTVHbC3种生物学特性展示了其发展为靶向人癌病毒的潜能。本文以人类原发性肝癌细胞感染BTVHbC3为模型系统，进一步报导其相互作用后的超微结构变化，以初步探讨BTVHbC3靶向抗癌的细胞生物学机制。

　　1  材料与方法

　　1.1  病毒与细胞    　　BTV HbC3株为本研究室于1994年湖北省分离的病毒株，人肝癌细胞Hep3B购自中国典型培养物保藏中心。Vero细胞为本室保存的BTVHbC3敏感增殖细胞株。Vero 细胞用于BTVHbC3的培养增殖和病毒效价测定；Hep3B细胞用于实验研究。

　　1.2  细胞培养、传代    　　Hep3B细胞采用含10％小牛血清的DMEM培养基，置于37℃，5％ CO2条件下培养，常规法培养传代Hep3B细胞分别于25ml 10个培养瓶里。

　　1.3  BTV HbC3病毒增殖及病毒悬液制备    　　采用添加10％小牛血清的DMEM培养基培养Vero细胞，待细胞生长至80％～90％时，接种BTV HbC3悬液1ml于培养瓶，置37℃吸附1h后，弃培养液，以2％小牛血清的DMEM培养液继续培养。观察细胞病变效应（CPE）达到90％时收获细胞，反复冻溶3次，使细胞完全脱离；破碎、释出病毒；4 000r/min离心15min，收集上清。按本研究室常规方法[1]进行病毒TCID50滴定，病毒效价为105 TCID50/ml。然后按每试管1ml病毒悬液分装于10个试管，－80℃冻存备用。

　　1.4  BTV HbC3感染Hep3B细胞的样品制备    　　按每25ml培养瓶接种0.1ml病毒悬液（104TCID50）于10瓶Hep3B细胞，吸附细胞lh后，弃病毒液，洗细胞2次，然后加入含2％小牛血清的DMEM培养基维持培养。根据病毒感染细胞病变的特性，分别在不同10个时间段：2h、4h、6h、8h、12h、18h、24h、32h、40h、48h收获细胞。所有收获细胞用PBS洗2遍，EDTA消化，1 500r/min离心10min，弃上清，加2.5％戊二醛室温固定lh后，送电镜室制片。

　　1.5  电镜超薄切片的制备及电镜观察    　　将所固定样品，用0.1mol／L二甲砷酸钠缓冲液(pH  7.4)在4℃下漂洗细胞2次，1％四氧化锇固定1h，梯度酒精脱水，Epon812包埋，LKB—V型超薄切片机切片，常规醋酸双氧铀和枸橼酸铅染色。日立H－600透射电镜观察。

　　2  结果　　　　2.1  BTVHbC3感染Hep3B细胞超微结构的动态观察

　BTVHbC3感染细胞2～4h时段， BTV吸附在细胞膜表面， 细胞膜逐渐包裹、 内陷， 以胞饮囊泡吞入方式进入细胞浆,  随之在溶酶体的酸性环境下脱去外衣壳， 将含病毒内衣壳和基因组的亚病毒核壳释放到细胞基质中（见图1）。 6～8h时， 胞浆内可见脱去部分外层衣壳的不完整病毒颗粒， 即亚病毒颗粒和病毒包涵体的形成（见图2）。 8～12h时， 病毒晚期蛋白合成， 主要是装配病毒颗粒的蛋白质、 酶和非结构蛋白。 胞浆内大量亚病毒颗粒装配上外层蛋白结构， 逐渐形成成熟的病毒粒子。 12～18h时， 病毒包含体裂解和子代病毒的释放达到高峰。 病毒释放通过内质网以出芽方式形成小泡， 转运高尔基复合体送出细胞外。 18～32h时， 胞浆内可见大量病毒增殖并伴随病毒包涵体裂解， 释放出感染性的子代病毒颗粒及病毒核物质。 释放的子代病毒感染新的宿主细胞， 新一轮复制周期开始， 病毒进入超感染期。 32～48h时， 大量细胞病变和凋亡、 胞质内均富含不同发育阶段的病毒颗粒， 完整病毒颗粒、 病毒空衣壳和核物质， 细胞溶解和病毒彻底释放（见图3、4）。 凋亡细胞核膜结构完整， 核内染色质浓缩、 成块、 边聚， 细胞浆中有增殖的病毒颗粒， 内质网明显扩展并形成空泡， 线粒体肿胀， 为典型凋亡特征。

　　图1  胞浆内溶酶体包裹病毒粒子，消化病毒外衣壳，释出亚病毒，如箭头所示(×30 000); （略）

　　图2  BTV包涵体形成( ×25 000); （略）

　　图3  包涵体：大量空衣壳；少量新病毒(  ×20 000); （略）

　　图4  BTV HbC3诱导Hep3B细胞出现大量凋亡细胞(  ×2 500)（略）

　　3  讨论    　　蓝舌病毒的外衣壳呈纤丝样结构，具有双层蛋白衣壳，主要由VP2和VP5结构蛋白组成。通过VP2蛋白吸附到细胞膜上，吸附与受体相关，而受体随机分布在细胞表面并与细胞骨架相连[3,4]。 我们观察到BTV HbC3吸附细胞受体后，以受体介导的胞饮作用吞入胞浆。穿入细胞的病毒颗粒在溶酶体水解酶的作用下完成部分脱壳，成为亚病毒粒子，亚病毒颗粒释放到胞浆基质中。已有实验表明[5]溶酶体的酸性环境有助于BTV的脱衣壳，外壳结构蛋白VP5可能在细胞质中被除去，以完成病毒在细胞里全部脱壳过程。    　　BTVHbC3感染Hep3B细胞早期可发现病毒包涵体(VIBs)。Brookes等[68]在BTV感染细胞4h开始检测到VIBs，并发现BTV多肽的合成发生在VIBs中，而装配发生在VIBs的周边。在BTV整个复制周期中，10个基因片段都包裹在病毒核心中，以避免启动宿主细胞的防御机制。该病毒的转录与复制可能在亚病毒颗粒中进行，并且病毒核心内含有RNA多聚酶等病毒早期转录、复制的酶类。BTV核心不断重复地将排列在核心中央腔成液晶状的10个基因片段转录成mRNA。病毒转录的mRNA在核心内加帽和甲基化后，从病毒二十面立体结构的顶端孔隙穿出，离开距病毒颗粒，很快与胞浆中的核糖体结合，在核糖体上翻译病毒蛋白产生核蛋白基质，形成VIBs。此外以正链RNA为模板，合成负链RNA，两条链组成双链RNA，并且与合成的病毒蛋白组成新的病毒颗粒。    　　NS3和NS3A是BTV最小基因S10编码的两种非结构蛋白。细胞化学表明[9,10]，NS3和NS3A是在合成后运输到高尔基氏器的成分；NS3和NS3A能与囊泡光滑的表面结合，含NS3／3A的囊泡将BTV运输到胞浆膜，病毒在胞浆膜以出芽或挤出的方式释放维持了细胞及膜结构的完整性。我们明显发现该病毒初期感染以挤压方式从细胞释放，因为此病毒为无包膜病毒粒子，其不可能通过芽生方式释出。    　　BTVHbC3感染细胞18小时后，释放的子代病毒再感染细胞，即病毒形成的超感染过程。释放到胞浆中的核心具有更高的转录酶活性，能产生更多的VIBs，这将有效地增加感染复数而加速整个病毒复制过程。最终，我们看到被感细胞进入凋亡，凋亡细胞溶解，子代病毒彻底释放。BTV感染细胞极大依靠子代病毒在细胞中超感染复制动力，加速细胞的凋亡和溶解进程，释放大量有感染性病毒。因而观察到BTV感染细胞后期以诱导细胞凋亡和溶解方式杀伤Hep3B细胞。

近几十年，靶向性抗肿瘤疗法成为攻克肿瘤的新的发展方向。呼肠孤病毒具有抑制肿瘤细胞的作用已被细胞、动物模型得到证实[1113]，主要是结构蛋白σ 3介导dsRNAPKR的活性，抑制了肿瘤细胞，成为溶癌病毒[14]。蓝舌病毒是dsRNA病毒，属于呼肠孤病毒科环状病毒属的代表种，主要危害绵羊及野生反刍动物，导致这类被感染动物高死亡率的致病性病毒。BTVHbC3株是本研究室1994年分离的一株新病毒，其感染细胞及发育周期一直未研究。本研究室已报导BTVHbC3株对人癌细胞感染的研究[1,2]，大量的体内外实验证实了BTVHbC3不感染人正常二倍体细胞，却在人某些肿瘤细胞中选择性增殖，诱导这些肿瘤细胞进入凋亡，从而靶向性杀死肿瘤细胞。本实验借助电子显微镜技术动态研究BTVHbC3感染并杀死人癌Hep3B的基本过程，为研究该病毒复制及抗癌机制提供实验依据。

【参考文献】  　　［1］ 肖安涛，董长垣．蓝舌病毒HbC3对几株人和动物肿瘤细胞的感染性研究[J]．中国病毒学, 2004,19(4):349352．　　　　[2] 罗翔，董长垣，郭淑芳,等．蓝舌病毒HbC3株靶向性杀死小鼠荷MA782肿瘤的研究[J]. 武汉大学学报(医学版)，2004,25(4):372379.

　　[3] Eaton Bt, Hyatt AD．Association of bluetongue virus with the cytoskeleton[J]．Virology, 1987, 157(1):107116.

　　[4] Gould AR， Hyatt AD， Eaton BT． Morphogenesis of a bluetongue virus variant with an amino acid alternation at a neutralization site in the outer coat protein VP2[J]．Virol，1988,16(5):2332.

　　[5] Hyatt AD，Eaton，BT，Brookes SM．The Release of Bluetongue Virus from Infected Cells and Their Superinfection by Progeny Virus[J]．Virology, 1989,173(1):2134．

　　[6] Zheng YZ, Hyatt A, Wang LF. Quantification of recombinant corelike particles of bluetongue virus using immunosorbent electron microscopy[J]. J Virol Methods, 1999, 80(1):19.　　　　[7] Brookes SM, Hyatt AD, Eaton BT. Characterization of virus inclusion bodies in bluetongue virusinfected cell[J]. J Gen Virol, 1993,74 (3):525530.

　　[8] Mertens PP, Diprose J. The bluetongue virus core: a nanoscale transcription machine[J]. Virus Res, 2004,101(1):2943.

　　[9] Hyatt AD, Zhao Y, Roy P. Release of bluetongue viruslike particles from insect cells is mediated by BTV nonstructural protein NS3/NS3A[J]. Virology, 1993, 193(2):592603.

　　[10]Hyatt AD, Eaton BT, Brookes SM. The Release of Bluetongue Virus from Infected Cells and Their Superinfection by Progeny Virus[J]. Virology, 1989,173(1):2134.

　　[11]Coffey MC, Strong JE, Lee PWK. Reovirus Therapy of Tumors with Activated Ras Pathway[J]. Science,1998,28(2):13321334.

　　[12]Strong JE, Coffey MC, Tang, D, et al. The molecular basis of viral oncolysis: usurpation of the Ras signaling pathway by reovirus[J]. EMBO J, 1998,17(4):33513362.

　　[13]Ohand AM, JaneValbuena J. Structure of the reovirus outer capsid and dsRNAbinding proteinσ3 at 1.8A resolution[J]. EMBO J, 2001,20(2):979989.

　　[14]Kara L, Norman, Patrick WK Lee. Reovirus as a novel oncolytic agent[J]. J Clin Invest, 2000, 105(8):10351038.