增殖缺陷型腺病毒介导人内皮抑素基因抗乳腺癌的实验

【摘要】  目的 通过建立裸鼠乳腺癌肿瘤模型，在体内实验中进一步证实携带人内皮抑素基因的增殖缺陷型腺病毒AdhE的抗肿瘤作用。方法 在BALB/c裸鼠皮下种植人乳腺癌细胞MCF7，建立移植瘤模型。在瘤体内注射AdhE治疗，观察肿瘤生长，免疫组化检测肿瘤细胞内皮抑素的表达和计数肿瘤间质中微血管的数量。结果 AdhE具有明显抑制肿瘤细胞生长的作用，瘤体内注射重组腺病毒后4周，AdhE治疗组肿瘤体积为（225.3±90.2）mm3，明显小于AdLacZ病毒对照组（794.9±189.8）mm3和空白对照组（890.7±102.5）mm3。免疫组化显示，乳腺癌细胞在感染腺病毒后能够有效表达内皮抑素，阳性细胞比率超过60％以上。AdhE治疗组瘤组织中血管数量（16.3±7.3）明显少于空白对照组（54.6±17.6）和AdLacZ病毒对照组（49.8±21.2）。结论 增殖缺陷型腺病毒介导人内皮抑素的表达，具有明显抑制肿瘤细胞生长的作用。

【关键词】  腺病毒 内皮抑素 乳腺癌 基因治疗

　　0  引言    　　近年来，抗肿瘤血管生成的基因治疗策略倍受关注［1］，已发现的多种具有抑制肿瘤血管生成的活性物质中以血管抑素和内皮抑素最为引人注意［2，3］。前期我们构建了携带人内皮抑素基因（human endostatin，hE）的增殖缺陷型腺病毒AdhE，并在体外细胞学实验中证实AdhE感染乳腺癌细胞株MDAMB231和MCF7后，可介导内皮抑素基因的高效表达，且表达的内皮抑素可明显抑制人脐静脉内皮细胞株ECV304细胞的生长［4］。在此基础上，本文通过建立裸鼠乳腺癌模型，开展体内实验进一步证实AdhE的抗肿瘤作用。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料来源    　　携带人内皮抑素基因（Human endostatin, hE）的增殖缺陷型腺病毒AdhE和携带报告基因LacZ的增殖缺陷型腺病毒AdLacZ由我们自己构建并保存，人乳腺癌细胞株MCF7购于美国ATCC细胞库，鼠抗人hE单克隆抗体、鼠抗人CD31单克隆抗体、SP免疫组化试剂盒购自福州迈新生物技术公司。

　　1.2  肿瘤模型的建立    　　5周龄BALB/c裸鼠30只，雌雄各半，中科院上海实验动物中心提供。取对数生长期的MCF7细胞，用PBS液调整细胞数至1×108/ml，按100μl／只接种于裸鼠乳房脂肪垫，恒温、通风、无菌条件下饲养。每日定时观察瘤体生长情况，当接种区皮下出现米粒至黄豆大小硬结，即为种植成功。

　　1.3  病毒治疗    　　将成瘤的裸鼠随机分为3组（AdhE组、AdLacZ组、空白对照组），每组10只，称重，编号。以1×108pfu/100μl的重组病毒（AdhE组、AdLacZ组）直接瘤内多点注射，隔日一次，共10次，总剂量1×109pfu／只。空白对照组以病毒保存液Ad Buffer（10mmol/L TrisHCl pH 8.0，2mmol/L MgCl2，4% Sucrose）代替重组病毒同步注射，100μl×10次。定时测量瘤体生长情况，以“a×b2×0.5”公式计算瘤体体积（a为最大径，b为最小径）。

　　1.4  病理检查    　　治疗后观察一个月，断颈处死小鼠，取瘤体标本，在PBS液中漂洗干净，以10%中性缓冲福尔马林固定，石蜡包埋，切片厚4μm，常规HE染色，观察肿瘤治疗后的变化情况。采用SP法进行hE表达和CD31血管标记的免疫组化染色。以PBS替代一抗作为阴性对照。HE染色以背景清亮、胞核或胞浆出现棕黄色颗粒者为阳性染色，每例随机计数5个高倍视野，阳性细胞数在10％以内为（－），大于10％为（＋）。CD31染色以纹理清晰的血管着色为一个计数单位，随机选择5个高倍视野，计数血管密度（MVD）。

　1.5  统计学处理    　　所有数据采用SPSS11.5分析软件进行统计学处理，以±s表示，均数比较采用Student’s ttest，以P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

　　2  结果

　　2.1  AdhE对裸鼠乳腺癌移植瘤生长的影响    　　BALB/c裸鼠接种人乳腺癌细胞MCF7后约20d成瘤，当直径达5mm左右开始治疗。自首次治疗至28d，肿瘤体积变化，见图1，AdhE治疗组肿瘤体积为（225.3±90.2）mm3，而AdLacZ病毒对照组为（794.9±189.8）mm3，空白对照组为（890.7±102.5）mm3。与空白对照组相比，AdhE治疗组已收到明显疗效，两组间存在显著性差异（P＜0.01）。而携带报告基因的对照病毒AdLacZ组与空白对照组相比无明显差异（P＞0.05）。

　　图1  携带人内皮抑素基因的增殖缺陷型腺病毒AdhE抗乳腺癌的动物实验（略）

　　2.2  病理检查结果    　　瘤组织病理切片，常规HE染色可见空白对照组和AdLacZ病毒对照组瘤细胞生长旺盛，异型明显，有小灶性坏死，而AdhE治疗组瘤组织中可见大片坏死灶，见图2a。对病理切片进行的hE免疫组化检查，可见AdhE治疗组癌细胞呈hE阳性表达，见图2b，阳性细胞比率为（68.5%±12.7%）。CD31标记肿瘤间质中的血管计数，发现AdhE治疗组瘤组织中血管数量（MVD=16.3±7.3）明显少于空白对照组（MVD=54.6±17.6，P<0.001）和AdLacZ病毒对照组（MVD=49.8±21.2，P<0.01），而空白对照组和AdLacZ病毒对照组之间没有差别（P>0.05）。AdhE治疗组肿瘤间质血管数量减少，残余的微血管多呈闭锁状态，见图2c、2d。

　　a：AdhE治疗组肿瘤出现大片坏死灶（×300）；b：AdhE治疗组肿瘤细胞hE表达阳性（×300）；c：AdhE治疗组肿瘤间质中微血管数量减少，管腔闭塞（×200）；d: 空白对照组肿瘤间质中微血管丰富密集（×200）

　　图2  乳腺癌移植瘤AdhE治疗后病理变化（略）

　　3  讨论    　　人内皮抑素是胶原18羧基端的一个片段，是迄今为止发现的疗效最好的血管生成抑制因子［5］。内皮抑素通过控制新生血管内皮细胞的增殖，从而抑制血管的形成，达到抗肿瘤的作用，且尚未发现副作用，不产生耐药性［6］。内皮抑素抑制内皮细胞增殖的机制非常复杂，涉及到多条信号转导途径，如与内皮细胞上的受体结合，诱导内皮细胞凋亡和G1期阻滞；抑制VEGF和bFGF等多种血管生长因子诱导的内皮细胞增殖和迁移；具有与金属蛋白酶和Zn2+结合能力，阻止这些物质刺激内皮细胞增殖的作用［7，8］。    　　利用载体把内皮抑素基因导入人体内发挥其抗肿瘤效应，是目前颇受关注的抗血管生成基因治疗策略。Blezinger等［9］采用动物肌肉注射内皮抑素基因表达质粒，Chen等［10］以阳离子脂质体介导的内皮抑素表达质粒静脉注入动物体内，两项研究均观察到肿瘤生长受抑制，血中内皮抑素浓度分别为8ng／ml和33ng／ml。而Sauter等［11］用重组腺病毒介导内皮抑素基因转至荷瘤裸鼠体内，发现血中内皮抑素持续明显升高，可达906ng／ml，同时还明显抑制了肺癌、乳腺癌的生长，与对照组相比，肿瘤体积减少78％。另有研究证实，经静脉注射导入内皮抑素基因后也出现了持续高水平的内皮抑素表达，平均浓度达到708ng／ml，在肝转移小鼠模型中，预防性单次注射携带内皮抑素基因的腺病毒后不仅延长了荷瘤小鼠的存活期，还起到完全防止肝转移形成的作用［12］。    　　体外实验已经证实，携带人内皮抑素基因的腺病毒感染乳腺癌细胞株MDAMB231和MCF7后，可介导内皮抑素基因高效表达，且表达的内皮抑素可明显抑制人脐静脉内皮细胞株ECV304细胞的生长[4]。本文通过在裸鼠体内建立人乳腺癌肿瘤模型，进行AdhE体内抗肿瘤实验。结果发现，裸鼠体内乳腺癌肿瘤细胞在感染AdhE后，能够有效表达内皮抑素，阳性细胞超过60％以上。表达的内皮抑素有效地抑制了肿瘤内新生微血管的形成，通过CD31标记进行血管计数，发现AdhE治疗组瘤组织中血管数量明显减少，且血管形态异常。而空白对照组和AdLacZ病毒对照组的血管数量丰富。实验证实，携带内皮抑素基因的增殖缺陷型腺病毒AdhE，在体内发挥了抑制肿瘤血管生长的作用。定期观察测量裸鼠移植瘤的体积，也发现AdhE控制肿瘤生长。瘤体内注射重组腺病毒后4周，AdhE治疗组肿瘤体积明显小于AdLacZ病毒对照组和空白对照组。结果显示腺病毒介导人内皮抑素的表达，具有明显抑制肿瘤细胞生长的作用，抑制率可达70％以上。

　本项研究提示，采用人内皮抑素基因进行的抗肿瘤血管生成的基因治疗策略，具有诱人的前景，可能是解决肿瘤治疗中复发和转移难题的有效手段之一。

【参考文献】  　　［1］ Mancuso A, Sternberg CN. Colorectal cancer and antiangiogenic therapy: what can be expected in clinical practice?[J] Crit Rev Oncol Hematol, 2005，55(1):6781.

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　　［11］Sauter BV, Martinet O, Zhang WJ, et al. Adenovirusmediated gene transfer of endostatin in vivo results in high level of transgene expression and inhibition of tumor growth and metastases[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2000，97(9):48024807.