宫颈鳞状细胞癌局部淋巴管生成与浸润转移及预后的关系

作者：林岷, 江忠清, 连成瑛, 郑秀, 吴桂珠, 曾赛凡    作者单位：1.福建医科大学基础医学院生理学与病理生理学系, 福州 350004

 【摘要】  目的 探讨宫颈鳞状细胞癌（SCC）局部淋巴管生成与临床病理特征及预后的关系。 方法 采用免疫组织化学SP法检测28例正常宫颈上皮(NCE)、36例宫颈上皮内瘤变(CIN)和68例SCC中血管内皮生长因子受体(VEGFR)-3、微淋巴管密度(LMVD)、Ki-67增殖指数(PI)和CD34微血管密度(MVD)。 结果 LMVD在NCE、CIN及SCC组分别为(2.24±3.82),(6.37±5.69)和(8.29±2.80)。从NCE,CIN到SCC,LMVD显著升高(P<0.01)。SCC组LMVD与盆腔淋巴结转移、间质浸润及预后密切相关(P<0.05),与年龄、FIGO分期、组织学分级、脉管浸润、PI及MVD无显著相关(P>0.05)。SCC有盆腔淋巴结转移及突破深肌层间质浸润者,其LMVD分别显著高于无盆腔淋巴结转移及未突破深肌层间质浸润者(P<0.05)。高LMVD的SCC患者生存率显著低于低LMVD者(P<0.001)。 结论 SCC局部LMVD升高可能预示肿瘤进展及不良预后。

【关键词】  宫颈肿瘤,病理学; 微淋巴管密度; 血管内皮生长因子受体-3; 转移; 预后; 免疫组织化学

　　The Association of Regional Lymphangiogenesis and Cancer Invasion, Metastasis and Prognosis in Squamous Cell Carcinoma of Cervix

　　LIN Min, JIANG Zhongqing, LIAN Chengying, ZHENG Xiu, WU Guizhu, ZENG Saifan

　　1.Division of Physiology & Pathophysiology, Fujian Medical University,Fuzhou 350004, China

　　2.Department of Obstetrics & Gynecology, The Affiliated First Hospital, Fujian Medical University, Fuzhou 350005, China

　　3.Department of Obstetrics & Gynecology, The Fujian Maternal ＆ Children Hospital, Fuzhou 350001, China

　　4.Department of Pathology, The Affiliated First Hospital, Fujian Medical University, Fuzhou 350005, China

    ABSTRACT:  Objective  To investigate the association of regional lymphangiogenesis and clinico-pathologic characteristics and prognosis in cervical squamous cell carcinoma.  Methods  The lymphatic microvessel density(LMVD) labeled by vascular endothelial growth factor receptor-3（VEGFR-3）, proliferation index(PI) of cancer cells labeled by ki-67 and microvessel density(MVD) labeled by CD34 in 28 cases of normal cervical epithelium(NCE), 36 cases of cervical intraepithelial neoplasm(CIN) and 68 cases of squamous cell carcinoma of cervix(SCC) were detected by immunohistochemistry SP method.  Results  The LMVD in NCE, CIN and SCC group were (2.24±3.82), (6.37±5.69) and (8.29±2.80), respectively. The LMVD increased remarkably from NCE to CIN and SCC accordingly(P<0.01).  In SCC, the LMVD correlated with pelvic lymph node metastasis, stroma involvement and prognosis(P<0.05), but not correlated with patient's age, FIGO staging, histological grading, intravascular infiltration, PI and MVD(P>0.05).  In the cases with pelvic lymph node metastasis and deeper stroma involvement, the LMVD were significantly higher than that in those without the conditions mentioned above(P<0.05).  The patients with higher LMVD in SCC had significantly lower survival rate than that in those with the lower LMVD(P=0.001).  Conclusion  The higher LMVD in SCC may predict cancer progression and bad prognosis.

KEY WORDS:  cervical neoplasm,pathology; lymphatic microvessel density; vascular endothelial growth factor receptor-3; metastasis; prognosis; immunohistochemistry

    血管内皮生长因子受体-3(vascular endothelial growth factor receptor-3,VEGFR-3),又称Flt4(fms like tyrosine kinase 4),属于血管内皮生长因子(VEGF)酪氨酸激酶受体家族成员,是VEGF-Ｃ和-D的特异受体,在胚胎发育期表达于能生成淋巴管的静脉内皮,随着胚胎的发育,VEGFR-3在血管内皮细胞的表达下降,主要表达于淋巴管内皮细胞［1］。VEGFR-3与配体结合,引起胞内区酪氨酸磷酸化,导致淋巴管内皮细胞增殖、分化等一系列生物学效应的发生［1］。近年来研究表明,VEGFR-3在肿瘤淋巴管生成及淋巴结转移中发挥关键作用［2-4］。笔者采用免疫组织化学SP法检测宫颈鳞状细胞癌（squamous cell carcinoma of cervix,SCC）局部VEGFR-3标记的微淋巴管密度(lymphatic microvessel density,LMVD),探讨其与局部血管生成、癌细胞增殖、侵袭转移及预后的关系。

　　1  材料与方法

　　1.1  对象

　　选择1998年3月-2005年6月在福建医科大学附属第一医院手术的宫颈上皮内瘤变(CIN)36例和SCC患者68例作为研究对象，年龄中位数45岁(24～72岁),<45岁30例,≥45岁38例。所有患者术前均未接受化疗、放疗及免疫治疗,均经病理确诊。选取正常宫颈上皮(normal cervical epithelium,NCE)28例作为对照。CIN和组织学分级及FIGO分期参照文献［5］。CINⅠ，Ⅱ，Ⅲ级分别为12,11和13例(其中原位癌4例)。FIGO分期Ⅰ期32例,Ⅱ期36例;SCCⅠ，Ⅱ，Ⅲ级分别2,19和47例;脉管浸润34例(脉管浸润的判断标准参照文献［6］),盆腔淋巴结转移17例;镜下早期浸润癌5例,浸润癌63例(浅、深肌层浸润分别15,48例)。截止到2006年12月底,对本组68例患者进行随访,共随访53例,随访率77.94%,随访时间平均54.8月（5~93月）。随访中死亡14例,3年生存率74.51％(38/51),5年生存率67.44％(29/43)。

　　1.2  试剂

　　浓缩型兔抗人VEGFR-3多克隆抗体(ZA-0267,工作浓度1∶100,北京中杉金桥生物技术有限公司)。即用型鼠抗人Ki-67单克隆抗体(克隆号MIB1)、即用型鼠抗人CD34单克隆抗体(克隆号QBEnd/10)、超敏免疫组织化学染色试剂盒和DAB染色剂（福州迈新生物技术有限公司）。

　　1.3  方法

　　所有新鲜标本均经4%甲醛溶液固定,48 h内取材,石蜡包埋,连续3~5 μm切片。采用免疫组织化学SP法检测CIN和SCC组织中VEGFR-3，Ki-67和CD34的表达情况。步骤按说明书操作。VEGFR-3，Ki-67和CD34均采用枸橼酸缓冲液高压热力修复抗原,DAB显色,苏木精对比染色。用已知阳性片作为阳性对照,用PBS代替第一抗体作为阴性对照。

　　1.4  结果判断

　　VEGFR-3阳性染色主要位于肿瘤边缘及间质微淋巴管内皮细胞质,呈棕黄色染色,可见微淋巴管内皮细胞围成壁薄、形态不规则的管腔结构,内无红细胞。低倍镜下观察4个淋巴管密集区域,200倍视野下计数淋巴管数,取其平均数作为LMVD［7］。Ki-67标记的增殖指数(proliferation index,PI):Ki-67在细胞核表达,阳性染色者呈棕黄色。在光镜下随机观察10个高倍视野(×400),每个视野记数100个肿瘤细胞,计算总阳性标记细胞数。CD34标记的微血管密度(microvessel density,MVD):CD34表达于血管内皮细胞质,呈棕黄色染色。MVD记数判断标准参照文献［6］。

　　1.5  统计学处理

　　定量资料以x±s表示,采用SPSS 10.0统计软件包,方差分析,变量间的关系采用相关分析,生存情况采用Kaplan-Meier曲线表示,Log rank检验。检验水准α=0.05,以P<0.05为差别有统计学意义。

　　2  结  果

　　2.1  NCE、CIN及SCC组LMVD

　在NCE、CIN和SCC组,VEGFR-3标记的LMVD分别为(2.24±3.82),(6.37±5.69)和(8.29±2.80)。NCE→CIN→SCC,LMVD显著升高(P<0.01,表1)。CINⅡ,Ⅲ的LMVD显著高于CINⅠ(P<0.01,表1)。NCE和CIN组VEGFR-3主要表达于基底膜附近微淋巴管内皮细胞质。SCC组VEGFR-3主要表达于肿瘤组织周边或间质淋巴管内皮细胞质,部分表达于肿瘤细胞质(图1A)。表1  NCE、CIN及SCC组LMVD（略）

　　2.2  Ki-67和CD34在NCE，CIN及SCC组的表达

　　NCE，CIN及SCC组Ki-67标记的PI分别为(96.04±54.60),(300.03±157.13)及(378.72±199.56)。NCE→CIN→SCC,PI显著升高(P<0.001)。Ki-67在NCE主要表达于上皮基底层细胞核,在CIN主要表达于异形细胞核,在SCC主要表达于癌细胞核（图1B）。CD34标记的MVD在NCE，CIN及SCC组分别为(6.3±2.9),(18.0±4.7)及(58.2±19.6)条。NCE→CIN→SCC,MVD显著升高(P<0.001)。CD34在NCE和CIN主要表达于上皮基底膜附近微血管内皮细胞质,在SCC主要表达于癌巢间质微血管内皮细胞质（图1C）。

　　2.3  CIN及SCC组LMVD与PI及MVD的关系

　　将CIN及SCC组LMVD以中位值为界分为高水平和低水平组。在CIN组,LMVD高水平者PI与低水平者比较无统计学意义(P>0.05),但LMVD高水平者MVD与低水平者比较有统计学意义(P<0.05,表2);在SCC组,LMVD高水平者PI及MVD分别与低水平者相比均无统计学意义(P>0.05,表2)。相关分析显示,CIN组LMVD与PI无显著相关性(r=0.099,P=0.567),但与MVD有显著相关性(r=0.373,P=0.025）;SCC组LMVD分别与PI及MVD均无显著正相关(PI:r=0.159,P=0.196;MVD:r=0.114,P=0.354)。表2  CIN及SCC组LMVD与PI及MVD的关系（略）

　　2.4  SCC组LMVD与临床病理特征的关系

　　SCC组LMVD与盆腔淋巴结转移及间质浸润密切相关(P<0.05),而与年龄、FIGO分期、组织学分级及脉管浸润无关(P>0.05,表3)。SCC有盆腔淋巴结转移及突破深肌层间质浸润者,其LMVD分别显著高于无盆腔淋巴结转移及未突破深肌层间质浸润者(P<0.05)。表3  SCC组LMVD与临床病理特征的关系（略）

　　2.5  SCC的LMVD与预后的关系

　　SCC组高水平和低水平组Kaplan-Meier生存曲线见图2。LMVD高水平组的生存率显著低于LMVD低水平组,Log rank检验,P=0.0009。

　　3  讨  论

　　3.1  VEGFR-3表达升高可能参与SCC的发展

　　VEGFR-3是淋巴内皮细胞上第1个被克隆的分子标志物,其基因定位于5q33-35,编码产物在人类有两种剪接异构体,长异构体Ｃ末端有额外65个氨基酸残基,在组织中检测到的主要类型为长异构体,参与淋巴内皮细胞活化后的信号转导。糖基化VEGFR-3相对分子质量为195 ku,胞外第5个Ig结构域被蛋白酶分解为相对分子质量分别为120 ku和75 ku的两条肽链,链间以二硫键连接。在胚胎淋巴管出现以前,VEGFR-3是心血管系统发育所必需的;在稍后的发育中,VEGFR-3则主要表达于淋巴管内皮细胞上;在成人淋巴管生成受到抑制,但在恶性肿瘤病变中淋巴管生成再次被激活,肿瘤细胞分泌VEGF-C,后者诱导淋巴内皮细胞表达VEGFR-3,进而形成淋巴管,在此环境下肿瘤细胞易于进入增生扩张的淋巴管中,最终产生淋巴结转移［8］。近年发现,淋巴管生长因子VEGF-C和VEGF-D通过作用于淋巴管内皮细胞上的特异受体VEGFR-3,引起淋巴管内皮细胞分化和增殖,导致淋巴管生成,而VEGFR-3是较特异的淋巴管内皮细胞标记物［1］。有文献报道,可依据VEGFR-3阳性染色计数淋巴管［8］。有研究报道,宫颈癌VEGFR-3表达显著升高［9-11］。笔者研究显示,NCE→CIN→SCC,LMVD显著升高(P<0.01)。VEGFR-3表达升高可能参与SCC的发展过程。笔者的结果与上述文献报道一致。Van等报道在SCC形成的不同时期,VEGFR-3表达具有显著差异,CINⅠ及CINⅡ与CINⅢ 比较差别显著(P<0.001),而CINⅢ与SCC比较却无明显差别,在SCC发展过程中,淋巴管形成的表型可能发生在CINⅢ期［12］。笔者发现,CINⅡ和CINⅢ的LMVD显著高于CINⅠ(P<0.01),而CINⅡ的LMVD与CINⅢ比较无统计学意义(P>0.05)。笔者结果与Van等的结果不一致［12］,可能与样本量少、判断标准不同等有关,有待进一步研究。

3.2  VEGFR-3表达与SCC血管生成及癌细胞增殖的关系

　　笔者研究结果显示,CIN组LMVD高水平者MVD显著高于低水平者(P<0.05),LMVD与MVD显著正相关;而SCC组LMVD高水平者MVD与低水平者相比无统计学意义(P>0.05),LMVD与MVD无显著相关性。丁国芳等报道,前列腺癌VEGFR-3表达与CD31标记的MVD显著正相关［13］。周莹等报道,乳腺癌VEGFR-3表达与MVD无显著相关性(P>0.05),VEGFR-3可能对血管生成无特异的促进作用［14］。笔者认为,VEGFR-3在肿瘤组织的表达和血管生成关系的研究可能有不同结果,有待进一步探讨。在CIN和SCC组,LMVD高水平者PI与低水平者相比均无统计学意义(P>0.05),两者也均无显著相关性。该结果提示,在SCC发展过程中,VEGFR-3可能不直接参与癌细胞增殖。Leu等报道,肿瘤淋巴管主要位于癌旁组织［15］。笔者也有相同的发现。刘琰等应用VEGFR-3反义核酸转染宫颈癌Hela细胞,发现其蛋白表达显著下降,宫颈癌细胞凋亡显著增加,应用VEGFR-3反义核酸可能通过降低宫颈癌细胞VEGFR-3表达,继而抑制VEGFR-3所介导的信号通路而发挥作用,既可阻断肿瘤的淋巴管转移,又可促使肿瘤细胞凋亡,不失为未来临床抗肿瘤治疗的一个新选择［16］。间接提示VEGFR-3有可能促进宫颈癌细胞增殖。

　　3.3  VEGFR-3表达与SCC浸润转移及预后的关系

　　国外多项研究表明,VEGF-C/VEGFR-3在肿瘤周边的新生淋巴管内皮细胞呈高表达,与肿瘤的淋巴结转移高度相关;VEGF-C可通过与VEGFR-3结合而促进肿瘤细胞的侵袭和转移,阻断VEGF-C或VEGFR-3的作用,能够抑制肿瘤淋巴道转移［2-4］。Birner等报道,宫颈癌VEGFR-3表达与淋巴结转移密切相关［9］。VEGF-C和VEGF-D是目前已知的VEGFR-3的两种特异配体,二聚化的VEGF-C或VEGF-D与VEGFR-3同源二聚体结合后可诱导淋巴管生成［1］。促进肿瘤淋巴管生成的机制可能是淋巴管生长因子与VEGFR-3结合后,通过MEK/ERK和PI3-激酶/Akt途径促进淋巴管内皮增殖,引起淋巴管管腔增大和数目增多,并可能改变原有和新生淋巴管内皮的通透性,改变肿瘤细胞和细胞外基质的黏附性,从而有利于肿瘤细胞向相邻淋巴管内转移［17］。笔者的结果显示,SCC LMVD与盆腔淋巴结转移及间质浸润密切相关(P<0.05)。SCC有盆腔淋巴结转移及突破深肌层间质浸润者LMVD显著高于无盆腔淋巴结转移及未突破深肌层间质浸润者(P<0.05)。笔者将SCC组LMVD以中位值为界分为高水平和低水平两组,两组患者生存率比较差别显著,LMVD高水平组患者的生存率显著低于低水平组。因此,笔者认为,SCC局部VEGFR-3高表达通过与其配体结合而促进淋巴管内皮细胞增殖,引起淋巴管增多,同时可能改变原有和新生淋巴管内皮的通透性,改变肿瘤细胞和细胞外基质的黏附性,从而有利于SCC细胞向深层间质浸润和向相邻淋巴管内转移,使患者生存率降低。

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