小肠腺癌中错配修复基因hMLH1的表达及意义
发表时间：2009-10-26 浏览次数：540次
小肠腺癌中错配修复基因hMLH1的表达及意义作者：李小燕 黄缘 作者单位：330006 南昌大学第二附属医院 【摘要】 目的 探讨DNA错配修复基因hMLH1在小肠腺癌中的表达及临床意义。方法 应用免疫组化SP法检测36例小肠腺癌及癌旁正常组织中hMLH1基因蛋白表达情况。结果 hMLH1蛋白表达率在小肠腺癌组（66.7％）低于癌旁正常组（91.7％），两组间差异有统计学意义（P＜0.05）。hMLH1失表达与患者年龄、性别、肿瘤部位、大小、浸润深度、有无淋巴结转移无关（P＞0.05），但是与肿瘤分化程度密切相关（P＜0.05），分化程度越低，hMLH1失表达越明显。结论 小肠腺癌中存在MMR基因的缺陷，hMLH1基因可作为判断肿瘤分化程度的一个生物学指标。 【关键词】 hMLH1 错配修复基因 小肠肿瘤 免疫组织化学0 引言 小肠腺癌的发病率低，症状缺乏特异性，在临床上容易误诊和漏诊，它的发生发展和结直肠癌一样，也是一个多基因多步骤的过程。错配修复基因hMLH1参与了很多人类肿瘤的发生。本实验应用免疫组化方法检测了小肠腺癌及癌旁正常组织中hMLH1蛋白的表达情况，并分析其与临床病理资料的相关性，以探讨hMLH1表达与小肠腺癌发生发展的关系及其临床意义。1 资料和方法 1.1 临床资料 收集南昌大学第二附属医院2003年1月～2005年9月临床资料完整的小肠腺癌石蜡包埋组织标本36例，其中男19例，女17例，年龄27～78岁，平均年龄（53.11±12.91）岁，并取相应的癌旁正常组织（距离肿瘤切缘＞5cm）36例。所有标本切片均经两位资深病理医师确诊，所有病例手术前均无放疗和化疗病史。 1.2 试剂和方法 即用型鼠抗人hMLH1单克隆抗体、SP试剂盒、DAB显色剂均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。采用免疫组织化学SP法（过氧化物酶标记的链霉素卵白素法）。免疫组化步骤严格按试剂盒要求操作。用已知的阳性片作阳性对照，用PBS代替一抗作阴性对照。 1.3 结果判定 hMLH1蛋白阳性表达的棕黄色颗粒主要定位于细胞核，少许位于胞浆。计数5个高倍视野或500个细胞，按照染色强度计分：0分为无着色，1分为淡黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色。按阳性细胞所占的百分比计分：0分为阴性，1分为阳性细胞≤10％，2分为阳性细胞占11％～50％，3分为阳性细胞占51％～75％，4分为阳性细胞＞75％。两者的计分乘积≤3分记为（－），＞3分记为（＋）[1]。 1.4 统计学方法 用SPSS13.0统计软件对实验数据进行统计学分析，采用四格表Fisher精确概率法，以P＜0.05为差异有统计学意义。2 结果 2.1 hMLH1在小肠腺癌和癌旁正常组织中的表达 hMLH1在小肠腺癌组织中的表达率为66.7％，在癌旁正常组织中的表达率为91.7％，两组间差异有统计学意义（P＜0.05），见表1、图1。 表1 hMLH1蛋白在小肠腺癌和癌旁正常组织中的表达（略） Tab 1 Expression of hMLH1 in cancerous and adjacent normal tissues of SBAC *：P<0.05 2.2 hMLH1的表达与患者临床病理特征的关系 hMLH1的表达与患者年龄、性别、肿瘤部位、大小、浸润深度、有无淋巴结转移均无显著相关性，但与肿瘤分化程度密切相关（P＜0.05 ），见表2。3 讨论 人类DNA错配修复基因(MMR)包括9个，即hMLH1、hMLH3、hPMS1、hPMS2、hMSH2、hMSH3、hMSH4、hMSH5、hMSH6,其中起主要作用的基因是hMLH1和hMSH2。hMLH1位于染色体3p21.3²23，基因组全长约58kb，含19个外显子，cDNA有2268bp的开放阅读框架，编码蛋白质756个氨基酸，其编码的蛋白质产物参与hPMS2结合形成异源二聚体，识别错配位点，参与错配修复，主要作用是保持遗传物质的完整性和稳定性,保证DNA复制的忠实性[2]。如果其功能发生缺陷或活性降低，复制过程中出现的错误不能及时被纠正,导致细胞突变频率的增加，由此有可能造成微卫星不稳定性（MSI）、相关癌基因、抑癌基因突变的不断积累，最终形成细胞的恶变，肿瘤形成。 表2 hMLH1的表达与小肠腺癌临床病理特征的关系（略） Tab 2 Relationship of hMLH1 expression with clinicopathlogical features in SBAC *：P<0.05 图1 hMLH1在癌旁正常组织中呈阳性表达(SP ×200) （略） 图2 hMLH1在癌组织中呈阳性表达(SP ×200) （略） 图3 hMLH1在癌组织中呈阴性表达(SP ×200) （略） Fig 1 Postive expression of hMLH in adjacent normal tissues(SP×200) Fig 2 Postive expression of hMLH in cancerous tissues(SP×200) Fig 3 Negetive expression of hMLH in cancerous tissues(SP×200) hMLH1蛋白在消化道、生殖腺等多种组织中存在着表达，它的异常表达无论在遗传性肿瘤还是散发性肿瘤中均有发现。据统计，37.4％的HNPCC（遗传性非息肉病性结肠癌）存在hMLH1蛋白表达下降或缺失[3]。而hMLH1蛋白表达缺失的散发性结直肠癌患者其消化道罹患多源性肿瘤的几率更大[4]。Song等[5]研究结果表明胃癌组织中hMLH1蛋白的失表达率为40%，与癌旁正常组织相比差异有统计学意义 (P＜0.05), hMLH1蛋白的失表达可能与微卫星不稳定性相关,并在胃癌的发生发展过程起重要作用。子宫内膜、前列腺癌中也都发现有hMLH1蛋白表达下降或缺失[6²7]。因此，hMLH1表达水平的降低能引起DNA错配修复功能低下，使癌相关基因突变不能及时纠正，导致肿瘤的易感性增加。 本研究中，hMLH1蛋白在小肠腺癌组织中的表达率为66.7％，低于癌旁正常组织中的表达率（91.7％），两组间差异有统计学意义（P＜0.05）。在36例小肠腺癌中，有12例hMLH1蛋白表达缺失，占33.3％，表明一定比例的小肠腺癌中存在着MMR基因功能缺陷。hMLH1蛋白的失表达与患者的年龄、性别、肿瘤的部位、大小、浸润深度及有无淋巴结转移均无明显相关性，但是与肿瘤的分化程度关系密切（P＜0.05），随着肿瘤分化程度降低，hMLH1蛋白的表达呈逐渐下降趋势，提示hMLH1的表达水平在判断小肠腺癌组织分化程度方面可能具有一定的意义。由于本研究中小肠腺癌病例较少，给研究带来一定难度，实验结果可能也受样本量影响，但是运用免疫组化技术检测hMLH1基因的蛋白表达，方法简便，快速有效，可以作为识别具有MMR基因功能缺陷的肿瘤的一种可用的方法[8]，检测得出的蛋白表达结果还可指导我们下一步的研究方向，如应用逆转录PCR (RT²PCR)对基因进行测序检测基因突变，应用甲基化特异性PCR（MSP）分析基因的甲基化等。【参考文献】 ［1］ 许良中,杨文涛.免疫组织化学结果的判定[J].中国癌症杂志,1996,6(4):229²231. [2] Peltomaki P.DNA mismatch repair and cancer[J].Mutat Res, 2001,488(1):77²85. [3] J Bronner CE,Baker SM,Morrison PT,et al.Mutation in the DNA mismatch repair gene homologue hMLH1 is associated with hereditary non²polyposis colon cancer[J].Nature,1994,368(6468):258²261. [4] Yamamoto M,Taguchi K,Baba H，et al.Loss of protein expression of hMLH1 and hMSH2 with double primary carcinomas of the stomach and colorectum[J]. Oncol Rep,2006,16(1):41²47. [5] Song WQ,Han CL,Chen Y, et al. Expression of cyclooxygenase²2, hMLH1 and hMSH2 proteins, and their relationship with microsatellite instability in gastric carcinoma［J］.Zhonghua Zhong Liu Za Zhi,2005,27(11):660²662. [6] Ju W, Park HM, Lee SN,et al.Loss of hMLH1 expression is associated with less aggressive clinicopathological features in sporadic endometrioid endometrial adenocarcinoma[J].J Obstet Gynaecol Res,2006,32(5):454²460. [7] Yeh CC,Lee C,Dahiya R.DNA mismatch repair enzyme activity and gene expression in prostate cancer[J].Biochem Biophys Res Commun,2001,285(2):409²413. [8] Thibodean SN,French AJ,Roche PC,et al.AItered expression of hMSH2 and hMLHl in tumors with microsatellite instabity and genetic alternations in mismatch repair genes[J].Cancer Res,1996,56(21):4836²4840.
