塞来昔布对鼻咽癌CNE2细胞增殖抑制的实验研究

塞来昔布对鼻咽癌CNE2细胞增殖抑制的实验研究作者：易芳,许新华,付向阳,戴德兰,李道俊,张昌菊    作者单位：1.443003 湖北宜昌三峡大学第一临床医学院 宜昌市中心人民医院肿瘤科；2.三峡大学肿瘤研究所，3.医学院    【摘要】  目的研究环氧化酶2抑制剂塞来昔布对鼻咽癌细胞CNE2增殖的影响。方法采用MTT法测定细胞代谢率，以流式细胞术观察细胞DNA含量和凋亡的变化情况，免疫组化SP法检测COX2的表达情况。结果塞来昔布对CNE2细胞有明显的增殖抑制作用，呈时间和剂量依赖性。细胞周期各时相DNA 含量改变明显，G0～G1期细胞显著升高 (由最初47.03%升至最高79.20%)，而S、G2～M期细胞明显下降；凋亡率显著增高。塞来昔布明显下调细胞中COX2蛋白的表达。结论塞来昔布对鼻咽癌CNE2 细胞有明显的增殖抑制作用，并且呈时间和剂量依赖性，使细胞聚集在G0/G1期,其机制涉及COX2依赖性途径。    【关键词】  塞来昔布,COX2,细胞增殖,鼻咽癌    Growth Inhibition of Nasopharyngeal Carcinoma Cell Line CNE2 by Celecoxib  YI Fang1，2, XU Xinhua1，2,FU Xiangyang1，2,DAI Delan1，2,LI Daojun1，2,ZHANG Changju31.Department of Oncology,Central Hospital of Yichang City,The First Clinical Medical College of Three Gorges University,Yichang 443003,China;2.Oncology  Research Institute of Three Gorges University,3.Medical CollegeAbstract：Objective To investigate the growth of nasopharyngeal carcinoma cell line CNE2 treated with a selective cyclooxygenase2 inhibitor, Celecoxib.MethodsThe cell survival rate was measured by MTT assay, the cell cycle and apoptosis were analyzed  using flow cytometric method (FCM), the expression of COX2 protein in CNE cells treated with Celecoxib was detected by SP method.ResultsCelecoxib remarkably inhibited the growth and proliferation of CNE2 tumor cells, which was demonstrated in a time and dose dependent effect. The DNA content in each phase of cell cycle has significantly changed as follows; cell numbers in G0~G1 fraction increased significantly (from 47.03% up to the highest percentage of  79.20%),  whereas it decreased in S and G2M phase of cell cycle. Apparently apoptosis was induced in CNE2 cells by celecoxib. From the result of immunochemistry SP method it suggested that Celecoxib dramatically suppressed the expression of COX2 in CNE2 cells.ConclusionCelecoxib effectively inhibited the growth and proliferation of CNE2 tumor cells which induces accumulation of tumor cells in G0/G1 phase. Importantly, the mechanism of antitumor effect by Celecoxib may include COX2 dependent ways.    Key words：Celecoxib; COX2; Cell proliferation; Nasopharyngeal carcinoma1材料与方法    1.1主要试剂塞来昔布购于安徽合肥森瑞化工有限公司，RPMI1640 培养基为美国Gibco公司产品，小牛血清为杭州四季青产品，噻唑蓝(MTT)为美国Sigma公司进口分装，碘化丙啶(PI)购于Sigma公司，鼠抗人COX2单克隆抗体为美国Santa Cruz产品，SP超敏试剂盒和DAB显色试剂盒均为北京中杉金桥生物技术有限公司产品。    1.2细胞培养人鼻咽癌细胞株CNE2 从中南大学湘雅医学院肿瘤研究所引进，培养在RPMI1640＋10%小牛血清＋双抗(青霉素100u/ml、链霉素100μg/ml)、37℃、5 %CO2中，每隔1～2d传代一次。    1.3MTT 法检测塞来昔布对CNE2细胞增殖活性的影响塞来昔布用95%的乙醇溶解，配成40mmol/L 的储存液备用。取指数生长期细胞用0.25%胰酶消化，稀释成1×105/ml，每孔200μl 接种于96 孔板并与下列浓度的药物共同培育：50、100、150μmol/L，对照组为含1ml/L乙醇的培养液。分别培养24h、48h和72h。培养结束后，每孔加MTT 20μl，继续培养4h，弃上清，加二甲基亚砜150μl，震荡10min使MTT结晶完全溶解，酶联免疫检测分析仪测定492nm 处吸光值(A492 )，计算不同浓度下的抑制率。抑制率＝[ (对照组A492-实验组A492)/对照组A492]×100%。    1.4流式细胞术检测细胞周期和凋亡根据MTT结果计算得出24h的IC50值约为80μmol/L。取对数生长期的细胞制成1×105/ml的细胞悬液接种于50ml培养瓶，培养24h后与下列浓度的塞来昔布80μmol/L、100μmol/L共同培育(24h)，收集细胞，离心洗涤，用70%的冷乙醇固定，4℃过夜。测试前用PBS 溶液洗2遍，核糖核酸酶(RNase) 100μg/ml水浴30min。再加碘化丙啶(PI)50μg/ml，室温避光孵育20min，300目的尼龙膜过滤后上流式细胞仪分析。    1.5SP法检测COX2蛋白的表达情况取对数生长期的细胞制成1×105/ml的细胞悬液，接种于预先置有洁净无菌盖玻片的6孔培养板中，待细胞贴壁后加入塞来昔布80μmol/L共同培育，同时设阴性对照组；24h后弃上清，用PBS洗3遍，再用冰丙酮固定15min，自然干燥后采用SP法检测，参照使用说明书进行。COX2阳性为细胞浆染成棕褐色。    1.6统计学方法采用SPSS10.0 统计分析软件。MTT采用单因素方差分析，细胞周期结果和COX2蛋白表达采用t检验。均以P<0.05为差异有统计学意义。2结果    2.1MTT法检测塞来昔布对CNE2细胞增殖的影响塞来昔布对CNE2细胞的增殖具有明显的抑制作用，随着给药剂量的增大，抑制作用增强，并且随着作用时间的延长，抑制作用增强，见图1。图1CNE2细胞与不同浓度塞来昔布培育后的生长抑制率    2.2塞来昔布对CNE2细胞增殖周期各时相及凋亡的影响80μmol/L 的塞来昔布处理24h对细胞有增殖抑制作用，G0/G1期细胞比例增加，S期细胞减少，100μmol/L 处理后，细胞在G0/G1期聚集进一步增加，S期细胞继续减少，并有G2/M期细胞数减少，见表1。表1塞来昔布对CNE2 细胞周期及凋亡的影响　　2.3塞来昔布对CNE2细胞中COX2蛋白表达的影响正常CNE2细胞经免疫组化染色后，细胞浆染成棕褐色，见图2a。经80μmol/L的塞来昔布处理24h后，CNE2细胞浆棕褐色较对照组变浅，即CNE2细胞中COX2表达下调，见图2b。3讨论　　选择性COX2 抑制剂塞来昔布的抗肿瘤作用引起了广泛的关注，已有报道塞来昔布剂量依赖性抑制结肠癌、胃癌、食管癌等多种实体动物肿瘤的生长[3]，对肝癌、乳腺癌等离体培养的癌细胞也有生长抑制作用[45]，有关塞来昔布应用于鼻咽癌细胞系的报道比较少。本研究通过观察塞来昔布对鼻咽癌细胞CNE2增殖的影响，探讨其可能的作用机制，揭示其对鼻咽癌的防治作用。本实验结果显示，塞来昔布对CNE2细胞的增殖具有明显的抑制作用，随着作用时间的延长和给药剂量的增大，抑制作用增强。MTT实验所得出的24h IC50值略高于相关报道[67]，其可能原因有实验条件的差异导致细胞生长速度不一致，细胞接种量的选择有差异。肿瘤细胞的最基本特征是细胞的失控性生长，而失控性增生的根本原因就是细胞周期调控机制的破坏[8]。流式细胞术行细胞周期分析显示：塞来昔布影响细胞各周期的正常比例，使G0/G1期比例增加，S期和G2/M期相应下降，提示塞来昔布通过抑制CNE2细胞DNA 合成，将细胞周期阻滞于G0/G1期，从而降低肿瘤细胞的增殖能力，产生抗肿瘤作用。COX2抑制剂抗癌途径包括COX2依赖性和非依赖性两种途径。Chan等[6]采用Western Blot检测CNE2细胞中没有COX2蛋白的表达或是蛋白的表达量太少无法检测，但我们的免疫细胞化学显示CNE2细胞胞浆COX2蛋白表达强阳性，至于产生这种差异的原因目前还不清楚，有待于下一步研究证实。SP免疫细胞化学显示塞来昔布处理后COX2蛋白表达量显著降低，塞来昔布显著降低CNE2细胞中COX2蛋白的表达，提示其抗肿瘤作用可能涉及COX2依赖性途径。塞来昔布抑制鼻咽癌CNE2 细胞生长可能是通过抑制COX2 蛋白表达，从而抑制其产物 PGE2的合成。本研究结果为塞来昔布抗鼻咽癌作用的机制提供了初步的实验依据。由于克服了传统NSAIDs 的一些副作用，包括塞来昔布在内的选择性COX2 抑制剂更有可能为鼻咽癌的防治开辟新的途径。【参考文献】［1］Xu XC.COX2 inhibitors in cancer treatment and prevention,a recent development[J].Anticancer Drugs,2002,13(2):127137.[2]许新华，胡国清，李道俊，等．环氧化酶2对鼻咽癌血管生成及预后的影响[J]．中华放射肿瘤学杂志，2003，12(3)：154157． [3]Kismet K,Akay MT,Abbasoglu O,et al.Celecoxib: a potent cyclooxygenase2 inhibitor in cancer prevention[J].Cancer Detect Prev,2004,28(2):127142.[4]Cui W,Yu CH,Hu KQ.In vitro and in vivo effects and mechanisms of celecoxibinduced growth inhibition of human hepatocellular carcinoma cells[J].Clin Cancer Res,2005,11(22):82138221.[5]Basu GD,Pathangey LB,Tinder TL,et al.Mechanisms underlying the growth inhibitory effects of the cyclooxygenase2 inhibitor celecoxib in human breast cancer cells[J].Breast Cancer Res,2005,7(4):422435.[6]Chan CM,Ma BB,Wong SC,et al.Celecoxib induces dose dependent growth inhibition in nasopharyngeal carcinoma cell lines independent of cyclooxygenase2 expression[J].Biomed Pharmacother,2005,59（Suppl 2）:S268271.[7]Chen PY,Long QC.Effects of cyclooxygenase2 inhibitors on biological traits of nasopharyngeal carcinoma cells[J].Acta Pharmacol Sin,2004,25(7):943949.[8]Vermeulen K,Berneman ZN,Van Bockstaele DR.Cell cycle and apoptosis[J].Cell Prolif,2003,36(3):165175.