人原发性直肠恶性淋巴瘤裸小鼠原位移植模型的建立及其生物学特性

人原发性直肠恶性淋巴瘤裸小鼠原位移植模型的建立及其生物学特性作者：刘秋珍 脱朝伟 张宁 杨波 朱希伟 王明耀　    作者单位：1 110003 沈阳，解放军第202医院普通肝胆外科； 2 110042 沈阳，辽宁省肿瘤医院    【摘要】  目的 建立人原发性直肠恶性淋巴瘤裸小鼠原位移植模型，探讨其生物学特性。方法 采用人直肠原发性恶性淋巴瘤切除术中的新鲜瘤组织块植入裸鼠的直肠黏膜层内，观察原位移植的成瘤率、移植瘤的侵袭和转移率。进行形态学(光镜、电镜)、免疫组织化学、染色体核型、流式细胞分析。结果 依据WHO新的分类标准，建成1株人直肠原发性(非霍奇金B细胞性)恶性淋巴瘤裸鼠原位移植模型HRBL0305。移植瘤组织病理学为(非霍奇金B细胞性)高度恶性淋巴瘤，免疫组织化学示CD19、CD20、CD22、CD45阳性，CD3、CD7阴性，染色体56～69条，流式细胞DI值为1.57～1.61，均为异倍体。HRBL0305已传至31代，共移植裸鼠187只。其肿瘤移植生长率和液氮冻存复苏成活率均为100%。肝转移率为45.4%，淋巴结和腹腔种植转移率均为38.0%，移植瘤在裸鼠的直肠内自主侵袭性生长，发生血液转移、淋巴转移和腹腔内种植性转移。移植瘤组织病理学、超微结构的观察、流式细胞DNA含量测定及染色体核型的分析，表明与人源直肠恶性淋巴瘤细胞相一致。结论 HRBL0305是首次建立成功的人直肠原发性恶性淋巴瘤裸鼠原位移植模型。该模型完整地重现了人直肠原发性恶性淋巴瘤的自然临床病理过程，且转移模式与临床患者相似。为研究直肠恶性淋巴瘤的生物学特性和实验治疗提供了理想动物模型平台。    【关键词】  直肠肿瘤 恶性淋巴瘤 肿瘤移植 肿瘤转移 疾病模型    Establishment of orthotopic transplantation model of human primary rectal lymphoma in nude mice and investigation of its biologic characteristics  LIU Qiuzhen, TUO Chaowei, ZHANG Ning, YANG Bo, ZHU Xiwei, WANG Mingyao. Department of Hepatobiliary Surgery, No.202 Hospital of PLA, Shenyang 110003, China    【Abstract】  Objective  To establish an orthotopic transplantation model of human primary rectal lymphoma in nude mice and investigate its biologic features. Methods  Histologically fresh lymphoma tissues from a case of primary rectal lymphoma were transplanted into rectal mucosa of nude mice. Tumorgenecity, invasion, metastasis, morphology (light microscopy, electron microscopy and immunohistochemistry) and DNA content of orthotopically transplanted tumors were studied and karyotype analyzed. Results  According to the new WHO classification of malignant lymphoma, an orthotopic transplantation model of human primary rectal lymphoma (nonHodgkin's, B cell) in nude mice (HRBL0305) was successfully established. Histopathological examination of transplanted tumors showed nonHodgkin's B cell lymphoma. CD19, CD20, CD22 and CD45 were positive, but CD3 and CD7 were negative. The number of chromosome was between 56 and 69. DNA index (DI) was 1.57～1.61 (i.e. heteroploid). So far, HRBL0305 has been passaged for 31 generations in nude mice. 187 nude mice were used for transplantation. Both the growth rate after transplantation and resuscitation rate of cells from liquid nitrogen cryopreservation were 100%. Liver metastasis rate was 45.4%; metastasis rates of both lymph node and celiac planting were 38.0%. Transplanted human primary rectal lymphoma could autonomously and invasively grew in the rectum of nude mice, and hematogenous, lymph node and celiac planting metastases occurred. Orthotopically transplanted tumors were consistent with the original human tumor in histopathological and ultrastructural features, DNA content and chromosomal karyotype. Conclusions  The study successfully establishes an orthotopic transplantation model of human primary rectal lymphoma in nude mice. In this model, the clinicopathologic course of human primary rectal lymphoma and metastasis pattern of the model were similar to those of the clinical patients.    【Key words】  Neoplasm of rectum; Lymphoma; Neoplasm transplantation; Neoplasm metastasis; Disease model    原发性直肠恶性淋巴瘤发病率占全部胃肠道淋巴瘤的0.1%～2%，直肠恶性肿瘤的0.4%～4%，是消化道罕见的恶性肿瘤［1］。病因学和发病机制迄今尚不清楚。临床起病隐匿，易与直肠癌混淆，术前诊断困难，误诊率高，预后很差［2］。由于缺少可供直接研究的肿瘤组织标本和实验研究用的动物模型，原发性直肠恶性淋巴瘤与直肠其他肿瘤相比，其基础和临床研究的深度和广度仍很受限。为深入探讨直肠恶性淋巴瘤的生物学行为，我们采用原发性直肠恶性淋巴瘤新鲜组织块裸鼠直肠原位移植及体内筛选的技术方法，成功地建立了能完全重现人直肠恶性淋巴瘤自然临床病理过程，且转移模式与临床患者相似的人原发性直肠恶性淋巴瘤裸鼠原位移植模型，命名为HRBL0305，旨在为直肠恶性淋巴瘤基础和临床研究提供理想动物模型平台，现报告如下。1  材料与方法    1.1  实验动物    BALB/Cnu/nu裸小鼠由中国医学科学院肿瘤研究所肿瘤医院动物室提供。鼠龄3～5周，体重17～20 g，雌雄兼用，在无特殊病原体(specificpathogen free,SPF)条件下的本院裸鼠室内饲养。    1.2  标本来源与处理    原发性直肠恶性淋巴瘤新鲜组织标本由辽宁省肿瘤医院提供。取自1例49岁男性患者，手术证实为直肠弥漫浸润型恶性淋巴瘤，肠壁有十余处浸润病灶，为圆形或不规则形，直径约0.7～2.5 cm，有的呈环形，均隆起于浆膜面，灰白色，瘤细胞浸润黏膜、黏膜下层、肌层，且多被侵袭破坏，整个肠壁增厚，灰白色。肠系膜淋巴结肿大互相粘连，肝脏见转移瘤结节。病理诊断：原发性直肠高度恶性淋巴瘤(非霍奇金B细胞)肝转移。无菌切取的原发灶和肝转移灶新鲜组织标本置入RPMI1640培养液中，清除非瘤组织，剪切成1 mm×1 mm×1 mm瘤组织块，供移植用。    1.3  原位移植与传代［3］    裸鼠在0.5%戊巴比妥钠(30 mg/kg)静脉注射麻醉下，取腹正中线切口，辨认直肠，在直肠的浆膜面向肠壁内做3 mm切口深达黏膜层，以100无损伤缝合线，经切口分别将2粒大小为1 mm×1 mm×1 mm原发灶、肝转移灶瘤小块固定于直肠壁黏膜层，70丝线缝合腹膜，50丝线缝皮。术后继续饲养，观察60～90 d。当荷瘤裸鼠处于濒死状态时，取其中1只荷瘤裸鼠用颈椎脱位术处死，系统解剖，取出移植瘤。一部分瘤组织以原代移植方法行鼠间连续传代，每次传代裸鼠5～10只不等；另一部分瘤组织液氮冻存备用，进行相关指标检测。其他荷瘤裸鼠饲养至濒死状态或自然死亡，以观察其肿瘤的生长、侵袭和转移。    1.4  观察项目    1.4.1  解剖学和组织学检查    全部荷瘤裸鼠均经详细解剖学检查。测量肿瘤体积、观察侵袭周围脏器情况；观察直肠上动脉、肠系膜下动脉、腹主动脉周围淋巴结、肝和脾等各脏器有无肿瘤转移。移植瘤组织、区域淋巴结和各脏器组织经100 ml/L中性甲醛固定，石蜡切片，苏木精伊红染色，光镜观察。    1.4.2  免疫组织化学染色［3］    采用LSAB法，对全部裸鼠直肠肿瘤或有器官转移的切片应用CD3、CD7、CD19、CD20、CD22、CD45抗体进行染色，所用试剂均购自DaKo公司。    1.4.3  电镜观察    移植瘤以2.5%戊二醛和1%锇酸双固定，Epon812包埋，超薄切片，铀铅染色，PHILIPSCM10透射电镜观察。    1.4.4  流式细胞DNA含量检测［4］    采用美国FACS420型流式细胞仪，对正常直肠黏膜细胞、移植瘤细胞进行DNA含量测定。    1.4.5  染色体检查    采用短期培养，不加有丝分裂刺激方法，收获的细胞常规制片，GTG法染色,显微镜下观察［3］。    1.4.6  恶性淋巴瘤组织学分类标准    采用2001年新的WHO分类方法［5］。    1.5  统计学处理    采用t检验，P<0.01为差异有统计学意义。数据以±s表示，在SPSS10.0统计软件上完成。2  结果    2.1  HRBL0305模型的建立及传代    2.1.1  HRBL0305原位移植模型    取自人原发性直肠恶性淋巴瘤原发灶和肝转移灶新鲜组织块，首代各移植裸鼠5只，均获得移植成功。目前已传至31代，共移植裸鼠187只。平均潜伏期为6.4 d，传代间期26.7 d。传代肿瘤成瘤率和液氮冻存复苏成活率均为100%。尸解发现：肿瘤弥漫侵袭直肠壁全层，整个肠壁浸润肥厚，可见许多圆形或不规则形的斑块状浸润灶，黏膜皱襞完全消失。表面见数个圆形、卵圆形或不规则多发性溃疡，大小0.4 mm×0.3 mm至0.7 mm×0.5 mm。边缘隆起，底部不平，切面见整个肠壁显著增厚，呈灰白色或灰黄色，均质状。经病理切片检查：187只裸鼠直肠均见淋巴瘤细胞弥漫侵袭生长，85只(45.4%)发生肝转移(图1)；72只(38.0%)发生直肠上动脉、肠系膜和腹主动脉周围淋巴结转移伴有广泛腹腔播散种植性转移和肠梗阻。    2.1.2  HRBL0305移植瘤生长特点    尸体解剖发现，人直肠恶性淋巴瘤在裸鼠的直肠黏膜、黏膜下层和肌层自主侵袭性生长，致使整个肠壁浸润肥厚。可见许多圆形或不规则形状的浸润病灶，黏膜皱襞消失，表面有溃疡形成。有的则可见累及肠管数厘米长的环形病灶。切面见整个肠壁增厚，灰白色或灰黄色，均质状。    2.2  HRBL0305的侵袭和转移    2.2.1  淋巴结转移    局限于腹腔、直肠上动脉、肠系膜下动脉、腹主动脉周围淋巴结，少数裸鼠有肝门淋巴结转移。依受累程度，淋巴结转移分为3期：①早期：只在输入淋巴管和边缘窦内出现瘤细胞团；②中期：瘤细胞进一步向副皮质和髓质内侵袭性生长； ③晚期：除在边缘部分残存少量淋巴结组织外，整个淋巴结几乎全为瘤细胞侵占。    2.2.2  肝转移    出现在原位移植第3周末，多数荷瘤裸鼠肝转移呈弥漫型，瘤灶可散布在肝左、右叶乃至全肝，呈大小不一，数目不等圆形或椭圆形灰白色的瘤结节。少数荷瘤裸鼠肝转移多局限在肝右叶，呈结节巨块形，在其周围有小瘤块散在，瘤灶位于肝实质内。转移灶小至血管内瘤栓；大至肉眼可见其大小为0.3 mm×0.4 mm和0.7 mm×0.9 mm，最大的为1.3 cm×2.0 cm。镜下见转移瘤细胞呈侵袭性生长(图2)。严重时肝组织由瘤结节替代。    2.2.3  腹腔种植转移    见于腹腔脏层、壁层腹膜及网膜、胃壁、肠壁、肠系膜种植的灰白色瘤结节。有的荷瘤裸鼠可见广泛腹腔种植的全腹腔肿瘤和肠梗阻。    2.3  HRBL0305组织病理与电镜检查    2.3.1  HRBL0305光镜下瘤细胞弥漫侵袭肠壁全层及黏膜表面，细胞大，圆形、卵圆或肾形，胞质少，可见多核瘤巨细胞，核大，呈圆形或不规则形，核染色质不均匀，可见核仁，病理核分裂象多见(图3)。    2.3.2  电镜下瘤细胞核大，核多形性，有的核有1～2条不规则深沟及不对称分叶，呈多叶核。少数核呈圆形或卵圆形，异染色质沿核膜聚集，核仁大小不一。多数瘤细胞胞质内细胞器少，主要为肿胀的线粒体及扩张的粗面内质网。    2.4  HRBL0305模型免疫组织化学检查    HRBL0305模型移植瘤细胞对CD19、CD20、CD22、CD45均呈阳性表达(图4)，对CD3、CD7均呈阴性表达。    2.5  HRBL0305模型瘤细胞DNA含量分析    HRBL0305模型原位移植瘤和瘤源人直肠恶性淋巴瘤的FCM检测均示异倍体，结果见表1。表1  HRBL0305移植瘤FCM DNA检测结果    2.6  HRBL0305染色体核型分析    HRBL0305原位移植瘤的染色体数目为56～69条，介于二倍体和三倍体之间，均为非整倍体。3  讨论    人原发性直肠恶性淋巴瘤裸鼠原位移植模型的建立,是研究直肠恶性淋巴瘤生物学和实验治疗的重要工具。人直肠恶性淋巴瘤原位移植裸鼠后，能否始终保持原有的生物学特征是模型建成与否的关键。本研究所建立的HRBL0305模型，经过长达3年鼠间连续传代，已传至31代。该移植模型不仅组织病理学、免疫组织化学表型、超微结构、DNA倍体水平和染色体核型的特点与人源直肠恶性淋巴瘤相一致，而且肿瘤的移植生长率和液氮冻存复苏成活率均为100%，说明该模型系统的生物学特性是稳定的。HRBL0305模型为系统开展直肠恶性淋巴瘤的诊断、手术、放疗、化疗、靶向基因治疗和抗肿瘤新药的筛选等前瞻性试验治疗创建了有利条件。同时，也为直肠恶性淋巴瘤的基础理论的研究提供了同一人体来源、稳定传代、容易重复的新鲜瘤组织标本和动物模型。    本研究发现HRBL0305模型展示的生物学行为与临床患者相似，如移植瘤在裸鼠直肠广泛侵袭性原位生长，腹部转移，伴广泛腹腔种植的全腹腔肿瘤，淋巴结转移，肝转移和直肠梗阻［6］。这些结果重现了直肠恶性淋巴瘤患者的临床自然病理过程，且转移模式与临床患者相似。因此，人直肠恶性淋巴瘤裸鼠原位移植模型是迄今为止，最接近人的直肠恶性淋巴瘤肝转移动物模型，具有重要价值。    肿瘤转移有器官特异性，转移细胞必须找到合适的靶器官，才能支持其移居生长，完成转移过程。我们发现肝脏是HRBL0305模型转移的特异器官。应用肝转移灶建立的HRBL0305模型肝转移率之高(100%)，转移程度之重，宿主生存期之短，均说明该模型恶性程度高，也证明了转移灶移植是提高转移率，建立高转移模型的有效方法。Cowan等［7］报道人非霍奇金淋巴瘤(nonHodgkin's lymphoma,NHL)肝转移率高达40%，而本研究187只荷瘤裸鼠HRBL0305模型肝转移率(45.4%)高于文献报道。Leichman等［8］报道的因结直肠癌转移而死亡的患者有45%～71%存在肝转移，提示直肠恶性淋巴瘤与直肠癌肝转移可能具有相似的发生率和转移模式。在这种明显肝转移表型的背后必定有其内在的转移分子机制。对肝转移灶和原发灶肿瘤细胞在体内移植进行筛选，可有助于寻找肝转移相关基因，为研究直肠恶性淋巴瘤肝转移机制和筛选早期诊断肝转移肿瘤标志物及治疗靶标打下基础。    综上所述，我们首次建立成功的HRBL0305模型，完整地重现了人直肠恶性淋巴瘤病变分为4期的全部临床过程［9］。为深入研究结肠恶性淋巴瘤的生物学特性、病因病理、侵袭和转移机制，实验治疗提供了理想的实验动物模型平台。【参考文献】  ［1］ Navarra G, Adani G L, Bardella E, et al. 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