癌基因Bmi-1引起中心体扩增的可能机制

作者  薛晓英,胡 荣,杨力伟,段惠军   作者单位：中山大学肿瘤防治中心实验研究部//华南肿瘤学国家重点实验室， 广东 广州 510060

【摘要】  　　【目的】 探讨Bmi-1引起中心体扩增的可能机制。【方法】 体外建立Bmi-1稳定高表达和Bmi-1-RNAi稳定起作用的细胞株， 采用免疫荧光染色法计数中心体（Microtub）异常复制的比率及定位细胞周期素蛋白D1（cyclinD1）和P27的表达，同时进行Western blot检测cyclinD1和p27在核中的表达量。【结果】 Microtub染色计数发现与对照细胞相比，中心体异常复制的比率在6-10B/Bmi-1细胞中升高，而在CNE2/Bmi-1-RNAi细胞中下降；免疫荧光染色和Western blot检测均发现cyclinD1蛋白在6-10B/Bmi-1细胞核内表达升高，而在CNE2/Bmi-1-RNAi细胞核内表达降低，P27蛋白则在两株细胞株中均呈现相反的变化。【结论】 Bmi-1可能通过调控cyclinD1-P27途径引起中心体扩增。

【关键词】  癌基因 Bmi-1 中心体扩增 cyclinD1-P27 基因表达

　　Possible Mechanism of Centrosomal Amplification Induced by Oncogene Bmi-1 　　WENG Gui-xiang, XU Li-hua, FENG Yan, YU Chun-ping, SONG Li-bing, LI Jun, ZENG Mu-sheng, ZHANG Ling

　　Cancer Center of SUN Yat-sen University//State Key Laboratory of Oncology in Southern China, Guangzhou 510060, China

　　Abstract:【Objective】 To investigate the possible mechanism of centrosomal amplification incuced by oncogene Bmi-1 (B-cell-specific moloney murine leukemia virus integration site 1).  【Methods】 Immunofluorescence staining were used to calculate the ratio of the abnormal centrosomal dupulication and investigate the location of P27 and cyclin D1 protein; Western blot was performed to detect the expression of p27 and cyclin D1 in nucleus. 【Results】 By Microtub counting, compared with the control cells, 6-10B/ pMSCV-Bmi-1 showed a higher ratio of abnormal centrosomal dupulication, while the ratio of centrosomal amplification was lower in CNE2/Bmi-1-RNAi cells. Moreover, higher expression of cyclin D1 was detected in nucleus of 6-10B/Bmi-1 cells, while CNE2/Bmi-1-RNAi cells showed lower expression of cyclin D1 in nucleus; meanwhile, P27 was upregulated by Bmi-1 overexpression and downregulated by Bmi-1 RNAi, which was according with the results from immunofluorescence staining. 【Conclusions】 Bmi-1 may induce centrosomal amplification by regulating cyclin D1-P27 pathway.      　　Key words: oncogene; Bmi-1; centrosomal amplification; cyclin D1-P27; gene expression

　　中心体在细胞的有丝分裂中对细胞两极纺锤体微管的形成起重要作用，在哺乳动物细胞中，中心体由一对中心粒及包绕在其周围的大量其它功能蛋白质组成，每一次细胞分裂都伴随着一次中心体的复制和分裂。在细胞分裂过程中，中心粒的正常复制对于染色体的正确分离起着关键作用，其活动与细胞分裂、激活及复制密切相关。正常情况下，中心体的复制周期与细胞的分裂周期紧密联系，但是在体外培养的肿瘤细胞及不同分期的肿瘤组织中则出现中心体的扩增，表现为细胞内产生两个以上的中心体[1]。癌基因Bmi-1在多种肿瘤中高表达，与肿瘤的发病有关[2，3]。本实验室的前期研究结果表明Bmi-1在鼻咽癌中亦呈现高表达，且可引起中心体扩增[4] ，并且证实在外源性高表达Bmi-1的细胞中，其P53、P21蛋白表达水平无明显改变，但是我们的芯片结果显示cyclinD1表达水平大大提高，因此，我们推测Bmi-1引起中心体扩增可能是通过Cylin D1-P27通路实现的。本文在本实验室前期研究的基础上，初步探讨了Bmi-1引起中心体扩增的可能机制。

　1  材料与方法

　　1.1  试 剂      　　主要有Cyclin D1 抗体（Santa Cruz，sc-753），P27抗体（Santa Cruz，sc-1641）,BMI-1抗体(upstate,05-637), α-tubulin抗体（Sigma，T6074），anti-fade（Invitrogen），puromycin，凯基核蛋白抽提试剂盒（南京凯基生物科技发展中心），BCA蛋白定量试剂盒。

　　1.2 细胞系和培养     　　人鼻咽癌上皮细胞株6-10B、CNE2采用RPMI1640（Gibco）加100 mL/L的胎牛血清（Hyclone）培养。

　　1.3  细胞株的建立     　　将Bmi-1全长克隆至pMSCV，Bmi-1-RNAi序列克隆至PRS，分别与包装质粒共转染293-FT细胞，得到逆转录病毒后分别用pMSCV 和pMSCV-Bmi-1感染6-10B，用PRS和 PRS-Bmi-1-RNAi 感染CNE2，puromycin筛选3 d，免疫印迹验证BMI-1 的表达。

　　1.4 免疫印迹      　　1 × 细胞裂解液提取细胞总蛋白，根据凯基试剂盒提供的步骤提取细胞核蛋白，BCA试剂盒进行蛋白定量，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转印到PVDF膜上，50 g/L脱脂奶封闭30 min，一抗室温孵育1 h，1 × TBST漂洗15 min × 3次，带有HRP(辣根过氧化物酶)标记的二抗室温孵育40 min，1 × TBST漂洗15 min × 3次，在暗房内加入发光液，通过氧化还原原理使之在胶片上感光，机器冲洗胶片。

　　1.5 免疫荧光染色     　　以 α-tubulin做为中心体的标记。按2 × 104个/孔的密度将细胞种在铺有cover slip的24孔板中，48 h后用预冷的甲醇置于-20℃固定10 min，1 × PBST快速洗1次，100 g/L的BSA室温封闭10 min，一抗（Sigma，1∶1 000）室温孵育1 h，1 × PBST洗10 min × 3次，避光加带有FITC标记的驴抗鼠二抗，室温孵育40 min，1 × PBST洗10 min × 3次，DAPI染核5 min，快速漂洗1次，风干后Anti-fade 封片，荧光显微镜下观察。

　　2  结 果

　　2.1  稳定细胞株的建立      　　收集稳定传至第7代的细胞6-10B/pMSCV和6-10B/pMSCV-Bmi-1，CNE2/PRS和CNE2/PRS-Bmi-1-RNAi的总蛋白，免疫印记检测BMI-1的表达，结果显示相对于对照细胞，BMI-1在6-10B/pMSCV-Bmi-1细胞中的表达显著性增高，而在CNE2/PRS-Bmi-1-RNAi细胞中仅能检测到BMI-1的微弱表达，提示BMI-1稳定高表达和Bmi-1-RNAi稳定起作用的鼻咽细胞株成功建立（图1）。

　　2.2   Bmi-1引起中心体扩增      　　荧光显微镜下观察，随机挑选10组不同的视野计数，计数每300个处于有丝分裂期的细胞出现异常中心体的细胞总数目。结果显示，6-10B/pMSCV细胞中仅有11个细胞出现两个以上中心体， 占3.67%，而6-10B/pMSCV-Bmi-1细胞中出现两个以上中心体的细胞增至36，比例为12%。相反，CNE2/PRS细胞中有44个细胞出现两个以上中心体，占15%，而在经Bmi-1-RNAi沉默的CNE2细胞中出现两个以上中心体的细胞数则降至18个，仅占6%,两者相差较大。用SPSS 13.0软件进行两组独立样本t检验统计，第1组6-10B pMSCV和6-10B pMSCV-Bmi-1之间t=-3.883，P=0.001，同样，第2组CNE2 PRS和CNE2 PRS-Bmi-1-RNAi之间t=3.9，P=0.001，提示两组中心体异常复制的个数差异有统计学意义。如图2示，结果说明Bmi-1可引起中心体的扩增，且对于中心体的扩增是必需的。

　　2.3   Bmi-1可能通过调控Cyclin D1-P27途径介导中心体扩增      　　抽提细胞核蛋白，Western blot检测CyclinD1和P27在细胞核中的表达，结果显示与对照细胞相比，cyclinD1蛋白在6-10B/ pMSCV-Bmi-1细胞核中表达升高，而在CNE2/Bmi-1- RNAi细胞核中表达则降低，P27则呈现相反的变化趋势，在总蛋白中二者呈现相同的改变，但是在浆蛋白中均无显著改变（图3）。免疫荧光染色法对CyclinD1进行定位及定量检测发现在6-10B/ pMSCV-Bmi-1细胞中CyclinD1在细胞核内的表达增高，P27蛋白则与cyclinD1呈现相反的变化（图4）。所得结果与Western检测结果一致，提示Bmi-1引起中心体扩增可能由调控CyclinD1-P27途径所介导。

3  讨 论      　　癌基因Bmi-1是多梳基因（polycomb of genes，PcG）家族的成员之一，PcG家族产物是由一系列保守、稳定抑制靶基因的蛋白质组成的反式作用因子，PcG家族产物的调控位点是多梳应答元件形成的复合物以介导相邻基因沉默。BＭＩ-1是一种广泛表达的核蛋白，与各种实体瘤的发生有关[6-10]。此外，还发现BＭＩ-1与细胞周期的调控密切相关，BＭＩ-1蛋白呈微粒状分布于染色体上，在细胞分裂间期呈紧密排列，而在整个有丝分裂期则变得非常松散。在整个细胞周期中，BＭＩ-1的磷酸化状态与其和染色体结合的状态呈一种相反的关系：在G1/S期，非磷酸化的BＭＩ-1特异地结合在染色体的核蛋白片段中，而在G2/M期，磷酸化的BＭＩ-1却没有与染色体结合[11]。同时BＭＩ-1可引起中心体扩增的现象已经证实，但有关其作用机制的探讨尚鲜见报道。      　　中心体的稳定和正常复制在保持遗传的稳定性和协调联系细胞其他活性中起到关键的作用，异常的中心体可导致染色体的异常分裂，最终是遗传的稳定性发生改变，干扰细胞的正常活动而发生肿瘤。中心体复制的调控机制主要有p53途径、cyclinD1途径等，但是我们的前期研究证实外源性BＭＩ-1高表达的细胞株，其P53水平并没有明显改变，而我们的芯片结果显示CyclinD1水平大大提高。因此，我们选择鼻咽癌高分化细胞株6-10B及低分化细胞株CNE2，在前者我们外源性的高表达BＭＩ-1，后者，我们采取Bmi-1 RNAi的措施，来检测一下Bmi-1对中心体复制的调节作用，并探讨其可能机制。P27是一种细胞周期抑制因子，可普遍抑制细胞周期蛋白的表达，但是细胞在得到一些生长因子刺激的时候，CDK4-cyclinD1在与P27蛋白结合形成具有活性的三聚体，同时P27在此三聚体中是没有活性的，所以就不能抑制其它的周期蛋白，两方面的作用，可刺激细胞越过检查点，中心体复制增加。细胞失去了检查点的控制，就会出现异常复制等。在我们的研究中，我们发现Bmi-1可以上调cyclinD1在核内的表达，同时下调P27在核内的表达，二者在总蛋白中呈现相同的改变，但是在胞浆内都没有明显改变，支持Bmi-1 引起的中心体异常复制是通过调节CyclinD1-P27途径实现的，关于Bmi-1上调cyclinD1的详细机制以及是否跟其他通路之间存在相互作用，尚需进一步研究。

【参考文献】  　　[1]康 洁. 细胞中心体的复制与调控 [J]. 长春师范学院学报，2004，23（4）：57-59.

　　[2]金顺钱. 中心体异常和肿瘤 [J]. 生物化学与生物物理进展, 2003，30 (4)：527-532.

　　[3]蔡 杨. 中心体异常、染色体不稳定和癌发生的相关性 [J]. 临床口腔医学杂志，2003，19（9）：571-573.