RNAi技术在鼻咽癌研究中的应用进展
发表时间：2009-10-17 浏览次数：452次
RNAi技术在鼻咽癌研究中的应用进展作者：黄坊综述, 赵颖海审校 作者单位：524023 广东湛江，广东医学院病理教研室 【关键词】 RNA干扰,鼻咽肿瘤,基因治疗 RNAi（RNA interference）是指生物体细胞内由内源或外源性双链RNA(doublestranded RNA, dsRNA)诱导的其同源靶基因mRNA特异性降解，导致转录后基因沉默(posttranscriptional gene silencing, PTGS)现象。RNAi作为一种全新的基因阻断技术有望成为肿瘤发病机制及治疗等方面研究的重要工具。本文就RNAi技术在鼻咽癌研究中的应用进展作一综述。1 RNA干扰 1998年，Fire等将正、反义混合的双链RNA(double stranded RNA,dsRNA) 注入线虫体内,诱发了比单独注入正义或反义链更强的基因静默,不但可以阻断整个线虫所有同源基因的表达,而且导致其第一子代同源基因静默,他们将这种现象命名为RNAi[1]，随后又陆续在多种生物体内发现了RNAi现象。 发挥RNAi作用的主要是siRNA，用于基因沉默的siRNA可通过体外合成或由一定载体将产生siRNA序列的基因导入靶细胞，借助细胞内RNA酶水解产生双链siRNA发挥作用。RNAi的确切机制尚未完全明了，目前观点认为，其作用主要包括两个阶段：（1）起始阶段：细胞内存在一种可特异性识别并切割dsRNA的核酸酶（Dicer酶），将进入细胞的dsRNA切割为数个3′端含有2个碱基突出的小分子(2123nt)干扰RNA片断(small interference RNA，siRNA)。（2）效应阶段：siRNA与一个核酶复合物结合形成RNA诱导沉默复合物（RNAinduced silencing complex RISC），RISC经ATP激活后，在解旋酶作用下，siRNA双链解离，其反义链与靶mRNA结合，降解靶序列，使目的基因沉默。另外，RNAi还有级联和放大效应，以正反馈的方式扩增沉默信号，最终高效抑制相关基因的表达[2]。 RNA干扰的特点:（1）高特异性：siRNA 只降解靶基因中与其同源的特异性序列，而对其他序列、其他基因的mRNA无影响；(2)高效性：小分子剂量的siRNA即可产生明显的RNAi效应；(3)siRNA作用存在时间、浓度依赖性；(4)可传递性和可遗传性：RNAi效应可在不同细胞间相互传递，在某些生物中还可遗传给子代。 稳定表达HBV的人肝癌细胞株HEPG2.2.15，转染针对HBV不同区段的shRNA后，病毒DNA产物抑制可达7天[3]，提示将RNAi用于抗病毒治疗潜在的可能性。在HPV18(+)的人宫颈癌细胞Hela和C4I中应用RNAi敲低E6和E7癌基因，可有效抑制肿瘤细胞生长[4]。癌基因Bmi1在多数恶性肿瘤中过表达，人乳腺癌组织及细胞中Bmi1和Mel18表达负相关，用RNAi敲低Bmi1可下调Akt/PKB活性，降低MCF7细胞的转化表型，提示在乳腺癌细胞中Mel18和Bmi1可能参与调节AKT通路，作为肿瘤抑制基因，Mel18通过抑制Bmi1表达，下调AKT活性发挥作用[5]。2 RNAi在鼻咽癌研究中的应用 Yin等[6]利用报道基因对鼻咽癌细胞系CNE1、CNE2和58F进行RNAi研究，结果显示三种鼻咽癌细胞系中均存在RNAi现象，为RNAi在鼻咽癌中的研究及应用提供了理论依据，该技术将有可能成为鼻咽癌研究与分子治疗的重要工具。 2.1 RNAi与EBVLMP1 EB病毒感染与鼻咽癌的发生密切相关，其编码的潜伏膜蛋白1（1atent membrane protein 1,LMP1）被认为具有癌基因功能，LMP1通过激活NFκB,PKC,AP1,JAKs/STAT等多个信号转导通路，参与调控细胞的增殖、分化、凋亡及侵袭和转移[7]，在鼻咽癌的发生、发展过程中起重要作用。Li等[89]用siRNA干扰LMP1后发现，人鼻咽癌细胞LMP1 mRNA表达降低，细胞周期出现G0～G1期阻滞，增殖减少，但并未增加凋亡，且抑制LMP1可上调Ecadherin的表达，提高鼻咽癌细胞贴壁能力，降低其运动及基底膜穿透能力，并可在裸鼠体内有效地抑制鼻咽癌向肝、肺转移[10]，说明干扰LMP1，可控制鼻咽癌的转移，为鼻咽癌的临床治疗提供参考。 2.2 RNAi与PTX1基因 最近研究发现，PTX1基因位于鼻咽癌高频扩增区+l2pl2Pll区段，在鼻咽癌组织中表达上调，可能是鼻咽癌发病的关键基因。通过构建稳定转染shPTX1的鼻咽癌细胞系，可在mRNA水平阻断PTX1基因表达，明显抑制鼻咽癌细胞6－10B的增殖，控制其失控性生长，同时诱导细胞凋亡，说明PTX1可通过促进细胞增殖和减少凋亡双途径致瘤[11]。 2.3 RNAi与bclxL基因 大多数头颈部肿瘤中bclxL高表达，利用RNAi特异性阻断bclxL将成为鼻咽癌基因治疗的新方法。李继霞等[12]针对人bclxL基因设计合成4条siRNA，分别转染至人鼻咽癌细胞CNE2Z中，发现各转染组bclxL mRNA表达水平不同程度下调，且以siRNA4转染组最明显；细胞生长增殖抑制率在一定范围内具有剂量和时间依赖性；各浓度siRNA4转染组可不同程度诱导CNE2Z细胞凋亡[12]。何承伟等[13]研究表明，转染bclxL shRNA重组质粒的CNE2Z细胞bcl2,bclxL,caspase3 mRNA及蛋白表达水平下降，p53蛋白表达水平上调，细胞凋亡增加。 2.4 RNAi与NGX6基因和Ezrin蛋白 NGX6是在鼻咽癌高频杂合性缺失区9p2122克隆的候选抑癌基因，在鼻咽癌中表达下调，并与其侵袭转移关系密切。Ezrin为ERM蛋白家族成员之一，是一种细胞膜与细胞骨架的联接体，既可参与细胞生长和信号转导，又可接受细胞外信号，使骨架蛋白重排、细胞运动能力增加，促进肿瘤远处转移。研究表明，NGX6高表达，鼻咽癌细胞增殖显著降低，在裸鼠中成瘤延迟，将NGX6不同突变体转染至人鼻咽癌细胞5－8F，其侵袭能力降低，而Ezrin在鼻咽癌组织及其细胞58F中高表达，应用RNAi阻断Ezrin可降低58F的侵袭、转移能力，且NGX6通过其胞质结构域与Ezrin相互作用并下调其表达，由此推测NGX6、Ezrin共同影响鼻咽癌细胞的侵袭与转移[1415]。 2.5 RNAi与CD44 近年来关于CD44与肿瘤转移的研究较多，但其能否作为肿瘤治疗的靶分子仍在探索之中。有研究表明用RNAi抑制人鼻咽癌细胞CNE2L2 CD44表达可明显降低体外培养肿瘤细胞的生长能力，减弱其在裸鼠体内的成瘤和转移，提示在CD44高表达肿瘤中运用RNAi技术进行CD44分子靶向治疗的可能性[16]。 2.6 RNAi与EGFR 鼻咽癌组织中表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）高表达，且LMP1可通过NFκB通路调节其活性，诱导其表达，促进鼻咽癌细胞增殖[17]。用siRNA靶向干扰人鼻咽癌细胞EGFR，其mRNA及蛋白表达均降低，细胞增殖速度减慢，并诱导细胞周期G1期停滞[18]，提示阻断EGFR可抑制鼻咽癌进展，EGFR可以作为鼻咽癌生物治疗的靶点。 2.7 RNAi与肿瘤血管生成 血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF)是重要的促血管生成因子，在肿瘤微血管形成中起重要作用，利用RNAi阻断VEGF将可能成为肿瘤治疗的有效途径。研究表明，靶向干扰人鼻咽癌细胞VEGF可明显抑制其mRNA和蛋白的表达，降低裸鼠体内肿瘤微血管密度，使局部坏死灶增加，说明阻断VEGF可抑制肿瘤的生长和浸润[1920]。 2.8 RNAi与端粒酶 抑制端粒酶活性可明显抑制肿瘤细胞生长，并可诱导细胞调亡。因此，应用RNAi技术特异性阻断端粒酶活性将有利于肿瘤的治疗。 鼻咽癌中端粒酶活性增加[21],贺楚峰等[22]针对hTERT基因不同位点设计出RNAi片段，分别转染至鼻咽癌CNE－2细胞，结果显示，转染组细胞hTERT mRNA及蛋白表达水平降低，细胞由G0G1期进入S期受阻，增殖速度下降，且以siRNA1和siRNA4更为明显，提示siRNA1和siRNA4所对应的hTERT区段可能是RNA干扰的最佳位点，也证明了RNAi作用的特异性。Wang等[23]研究发现，转染人hTERT shRNA后，端粒酶活性被明显抑制，cmyc、增殖细胞核抗原（PCNA）蛋白表达均降低， caspase3蛋白表达上调，鼻咽癌细胞增殖受到抑制。 2.9 RNAi与鼻咽癌化疗增敏 Mei等研究发现靶向干扰LMP1可增加鼻咽癌细胞对博来霉素和顺铂的化学敏感性，而共转染有活性的AKT和LMP1 siRNA组成的质粒则降低C6661细胞对化疗药物的敏感性，导致肿瘤细胞耐药，推测AKT信号通路可能直接影响siRNA对LMP1靶向干扰作用[24]。鼻咽癌细胞HNE1T3中，TWIST基因表达上调可增加细胞对紫杉醇的耐受，用RNAi抑制TWIST表达则可提高鼻咽癌细胞对紫杉醇的敏感性[25]。 MAD2B是人检测点蛋白MAD2的同系物，是促分裂后期复合物（Anaphasepromoting complex，APC)的抑制因子，通过与CDH1和CDC20直接结合抑制APC的活性[26]。通过RNAi沉默MAD2B基因的表达,可提高鼻咽癌细胞对DNA损伤抗癌剂的敏感性，提示MAD2B作为鼻咽癌化疗增敏的靶点的新思路[27]。3 结语 RNAi在鼻咽癌相关基因,细胞周期蛋白及调节因子,抗凋亡基因, 转移相关基因,信号转导调节因子等干预方面及鼻咽癌放、化疗增敏的研究中尚待进一步深入，相信随着该技术不断成熟，其将在鼻咽癌及其他肿瘤的治疗中产生重大的应用价值。【参考文献】［1］ Fire A, Xu S, Montgomery MK, et al． Potent and specific genetic interference by doublestranded RNA in Caenorhabditis elegans[J]．Nature,1998,391（6669）：806811．[2] Izquierdo M．Short interfering RNAs as a tool for cancer gene therapy[J]． Cancer Gene Ther， 2005，12(3)：217227．[3] Kayhan H， Karatayli E， Turkyilmaz AR，et al． Inhibition of hepatitis B virus replication by shRNAs in stably HBV expressed HEPG2 2.2.15 cell lines[J]．Arch Virol， 2007，152(5)：871879．[4] Lea JS，Sunaga N，Sato M，et al．Silencing of HPV 18 oncoproteins With RNA interference causes growth inhibition of cervical cancer cells[J]．Reprod Sci，2007，14(1)：2028．[5] Guo WJ， Zeng MS，Ajay Yadav， et al． Mel18 Acts as a Tumor Suppressor by Repressing 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