蒿甲醚抗SD大鼠原位脑胶质瘤血管生成的实验
发表时间：2009-10-09 浏览次数：542次
蒿甲醚抗SD大鼠原位脑胶质瘤血管生成的实验作者：伍治平 高诚伟 吴永贵 朱启顺 王熙才 刘馨 刘淳 作者单位：650118 昆明医学院第三附属医院肿瘤研究所； 云南大学化学工程学院；云南中医学院基础医学院;云南大学生命科学院 【摘要】 目的 探讨蒿甲醚（Artemether）抗SD大鼠原位脑胶质瘤血管生成作用。方法 采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定不同浓度蒿甲醚对大鼠C6脑胶质瘤细胞株的生长抑制作用，计算半数抑制浓度(IC50)。采用立体定位仪在SD大鼠大脑皮质层接种C6脑胶质瘤细胞（1×106/μl）40只，雌、雄各半；随机分为5组，每组8只。在接种第3天后，各组采用灌胃给药法连续给药10天。于接种后的第20天解剖大鼠，经活体左心室灌注4%多聚甲醛，固定肿瘤的全脑标本。在大鼠脑部接种穿刺点做冠状切口，按垂直和水平方向测量肿瘤大小。肿瘤体积=a2bπ∕6(a为肿瘤的短径，b为肿瘤的长径)。全脑标本用4%多聚甲醛固定,肿瘤组织做病理观察，免疫组化方法检测移植瘤组织微血管密度。结果 各实验组血管计数分别为Ⅰ组（39±4），Ⅱ组（29±6），Ⅲ组（12±8），Ⅳ组（10±5），生理盐水组为（52±7）。各实验组血管计数均明显少于生理盐水对照组，差异有统计学意义(分别P<0.05， P<0.01)。各实验组SD大鼠原位脑胶质瘤体积较对照组显著减小。结论 在一定剂量范围内，蒿甲醚具有明显抑制SD大鼠原位脑胶质瘤血管生成作用；蒿甲醚抑制原位脑胶质瘤生长和转移的机制之一是透过血脑屏障抑制脑胶质瘤血管生成。 【关键词】 蒿甲醚 SD大鼠C6脑胶质瘤细胞株 原位脑胶质瘤 动物模型0 引言 肿瘤的增殖、浸润和转移依赖于血管生成（angiogenesis）。血管生成是肿瘤生长和转移的基础，缺少新生血管的肿瘤往往被限制在很小的范围内，体积仅为1～2mm3[1]，对机体不构成危害。 蒿甲醚（Artemether）为青蒿素的脂溶性衍生物，在临床上治疗恶性疟和脑型疟有显著疗效。近年的研究发现，青蒿素及其衍生物有明确的抑制肿瘤血管生成的作用[2]。本项研究根据青蒿素及其衍生物能透过血脑屏障(blood²brain barrier)进入脑组织以及能抑制肿瘤血管生成等特性[3]，进行了蒿甲醚对SD大鼠脑部原位接种C6脑胶质瘤的抗肿瘤血管生成实验研究，为该药作为抗脑肿瘤血管生成药物的开发奠定基础，为临床应用提供科学依据。1 材料与方法 1.1 材料 药物：蒿甲醚片(昆明制药集团股份有限公司,50mg, 批号:05106702)；复方硫酸亚铁胶囊（河南福森药业有限公司，50mg,批号：061103）。实验动物：SD大鼠，6～8周龄，体重200～250g（昆明医学院实验动物科，批准文号：SCXK滇P0005²0008）。瘤株：SD大鼠C6脑胶质瘤细胞株，购自中国科学院昆明动物研究所，保存于液氮。 1.2 方法 1.2.1 MTT比色法检测蒿甲醚对C6细胞的抑制率 液氮罐复苏并且培养大鼠脑胶质瘤细胞株C6细胞；取对数生长期的细胞株，用0.25％胰蛋白酶消化汇合的单层细胞，将细胞收集到10％ FBS RPMI ²1640培养基中；离心细胞悬液，使细胞沉积，用培养基重悬细胞，计数。调整细胞浓度为1×105/ ml；分组：每组设5个平行孔，其中空白对照组只加培养基；阴性对照组为培养细胞，不加药。蒿甲醚浓度梯度为200、100、50、25、12.5、6.25、3.125μg/ml；96孔板各孔中加入200μl细胞悬液(空白对照组除外)，每孔加2×104 个细胞，培养24h；离心弃去培养基，分别加入不同浓度的蒿甲醚，并且设阴性对照和空白对照，分别作用24h、48h、72h；每孔加入5mg/ml的 MTT（SIGMA公司） 20μl，继续培养4h；各孔加入DMSO（SIGMA公司） 150μl溶解甲瓒，震荡10min后酶标仪测定OD值，测定波长为570nm，参考波长为655nm；计算抑制率，求出IC50值，比较不同浓度及作用时间蒿甲醚对C6细胞的抑制率。 抑制率＝[(阴性对照组A值-空白对照组A值) - (实验组A值-空白对照组A值)]/(阴性对照组A值-空白对照组A值)×100% 1.2.2 SD大鼠模型的建立 复苏C6脑胶质瘤细胞株，用含10%标准小牛血清（中国科学院生物工程研究所 灏洋生物）的RPMI 1640（GIBCO）全培养基常规传代培养。将对数生长期的细胞调整为适宜浓度1×106/μl。取体重在200～250g的成年SD大鼠，10%戊巴比妥那注射麻醉(0.3ml/100g)，将麻醉后的大鼠头部固定在脑立体定向仪上，常规备皮，消毒，铺巾；内眦连线与头部正中矢状面交点向后纵向切开头皮约1cm，分离，暴露颅骨；以牙科电钻（转速2000r/min）在颅骨上钻一小孔，注射位点为冠状缝前1mm，中线右旁开3mm，深5mm；20μl微量注射器抽取C6细胞悬液15μl (1×106个)，注射完毕后留针3～5min，缓慢拔针。骨孔用明胶海绵填充后，骨蜡封闭； 生理盐水冲洗手术野，缝合切口后消毒皮肤即可。 1.2.3 动物分组及给药 将40只（雌、雄各半）脑皮质层接种了C6脑胶质瘤的SD大鼠随机分成5组，每组8只。Ⅰ组，对照组，生理盐水0.4ml /（20g·d）、Ⅱ组，蒿甲醚33.3mg/( kg·d)、Ⅲ组，蒿甲醚 50.0mg/( kg·d)、Ⅳ组，蒿甲醚 66.6mg/( kg·d)、Ⅴ组，蒿甲醚50.0mg/( kg·d) + 硫酸亚铁1.5mg/( kg·d)。在接种第3天后，各组采用灌胃给药法连续给药10天。于接种后的第20天解剖大鼠，经活体左心室灌注4%多聚甲醛，固定含有肿瘤的全脑标本。大鼠的表面接种穿刺点做冠状切口，按垂直和水平方向测量肿瘤大小。肿瘤体积=a2bπ∕6(a为肿瘤的短径，b为肿瘤的长径)。肿瘤的全脑标本用4%多聚甲醛固定。 1.2.4 HE染色和免疫组化 上述肿瘤组织标本经常规处理后制成5μm厚石蜡切片,HE染色,常规光镜检查； LSAB免疫组化,采用鼠抗鼠CD31因子单克隆抗体为一抗，DBA显色，苏木素复染，以PBS代替一抗作阴性对照，检测肿瘤标本中血管生成的情况。按照Weidner等[4]提出的鉴别肿瘤微血管方法，在低倍镜下选取血管密度高的区域，再在400倍镜下计数血管，以能通过1个红细胞的小血管或单个内皮细胞作为一根微血管。计算每切片中5个血管生成热区血管数的平均值作为微血管数目。 1.3 统计学方法 采用统计学分析软件SPSS13.0对各组微血管密度值进行统计学分析，比较各组之间有无统计学差异；肿瘤体积按One²Way ANOVA进行方差分析，比较组与组之间有无统计学差异。P＜0.05为有统计学意义。2 结果 2.1 MTT 法检测蒿甲醚处理后C6细胞的抑制率 经不同浓度的蒿甲醚处理不同时间后，C6细胞生长均受到不同程度的抑制，抑制率随药物浓度和作用时间的增加而增大，重复测量的方差分析结果显示，不同浓度各组之间以及同一浓度不同时间各组之间差异有统计学意义，P＜0.01，见表1。 表1 MTT 法检测蒿甲醚处理后C6细胞的抑制率（略） Tab 1 Inhibitory rate of C6 cells treated with artemether by MTT assay 2.2 SD大鼠原位脑胶质瘤体积变化 各实验组肿瘤体积与生理盐水组比较，差异有显著性（分别P<0.05，P<0.01）；各实验组间比较，除Ⅰ组与Ⅳ组差异具有统计学意义外(P<0.05),其余各组差异均无统计学意义 (P>0.05)，见表2。 2.3 血管计数 各实验组血管计数分别为Ⅱ组（39±4），Ⅲ组（29±6），Ⅳ组（12±8），Ⅴ组（10±5），生理盐水组为（52±7）。各实验组血管计数均明显少于生理盐水对照组，差异有统计学意义(分别P<0.05，P<0.01)，见图1。 表2 口服不同剂量蒿甲醚时SD大鼠原位C6脑胶质瘤的抑瘤率和瘤体积变化情况（略） Tab 2 Inhibitory rates, volume change of orally Artemether at different dosages for glioma growth in brain tumor bearing SD rat △ ：vs. normal saline group，*：P<0.05;**：P<0.013 讨论 血管生成是肿瘤生长和转移的前提和基础，通常情况下，没有血管生成的肿瘤往往生长缓慢，病变长期处于静止状态，仅能局部浸润，尚不能发生转移[5]。肿瘤内的新生毛细血管网是在周边组织原有血管的基础上向肿瘤组织内延伸、扩展而形成的。这些血管一方面为肿瘤细胞提供营养物质，排泄代谢产物；另一方面也为肿瘤细胞侵袭进入血液循环系统向远处转移提供了机会。因此，血管生成是肿瘤转移连锁过程开始的关键环节。因此，抗血管生成的较好靶点是内皮细胞，通过抑制血管内皮细胞的增殖、迁移、管腔形成三个环节能有效地抑制血管生成，而抑制了血管生成，就能够有效地抑制肿瘤的增殖、浸润和转移。 From a to e, MVD of C6 generally decreased under pathological observation of C6 glioma by microscopy a：Control group, b：33.3 mg/(kg·d), c：50mg/(kg·d), d：66.6mg/(kg·d), e：Artm 50mg/(kg·d)+ ferrous sulfate 1.5mg/(kg·d) 图1 蒿甲醚抑制C6脑胶质瘤血管生成的免疫组化观察（CD31，×400）（略） Fig 1 Immunohistochemical images of C6 brain glioma angiogenesis by orally Artemether（CD31，×400） 本研究结果显示，在一定的剂量范围内，青蒿素脂溶性衍生物蒿甲醚（Artemether）能使SD大鼠脑部原位接种C6脑胶质瘤的生长减缓，瘤体积减小，微血管生成数量减少。导致上述结果的原因我们认为有如下两个方面：（1）蒿甲醚作为治疗恶性疟疾和脑型疟具有显著疗效，已广泛应用于临床，证明该药能够透过血脑屏障而达到治疗脑型疟疾的目的[6]；青蒿素及其衍生物有明确的抑制肿瘤血管生成作用[7]。（2）蒿甲醚抑制SD大鼠脑部原位脑胶质瘤血管生成的机理有可能是蒿甲醚抑制了血管内皮细胞的增殖、迁移等起始步骤；亦有可能是蒿甲醚通过下调原位脑胶质瘤血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表达[8]。但蒿甲醚抑制新生血管生成作用是否还包括其他的机制,尚需要进一步深入研究。 本研究结果还显示，蒿甲醚与铁剂合用具有协同抑瘤作用,增加抑瘤率，其增加抑瘤率的机制可能与肿瘤细胞铁代谢旺盛的特点有关[9]。所有增殖态的细胞都需要摄入铁，铁摄入越多，其增殖就愈快。 因此，肿瘤细胞将比正常细胞吸收更多的铁离子，在有转铁蛋白存在的情况下或给硫酸亚铁，青蒿素分子内的过氧化基团与亚铁离子起反应产生自由基或亲电子中间产物，攻击细胞膜或细胞内其他膜性结构，或直接氧化损伤蛋白质分子或生命大分子（这些蛋白质对肿瘤细胞的过度增殖起关键作用），导致细胞死亡。这样可选择性杀伤癌细胞而对正常细胞损伤较小[10]。 综上所述，在一定剂量范围内，蒿甲醚具有明显抑制SD大鼠原位脑胶质瘤血管生成作用；蒿甲醚抑制原位脑胶质瘤的生长和转移的机制之一是透过血脑屏障抑制脑胶质瘤血管生成。【参考文献】 ［1］ Folkman J. 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