免疫重建荷人卵巢癌-SCID鼠模型的建立

   作者：赵卫东　张爱君　凌斌　王群华　陈峥峥　姚凤球　周颖　申震    作者单位：安徽省立医院 安徽省分子医学重点实验室，安徽 合肥 230001

   【摘要】  ［目的］ 探讨建立具有人免疫学特征的卵巢癌-SCID鼠模型的可行性。［方法］ 将16只雌性SCID小鼠随机分为4组。A组：磷酸盐缓冲液( PBS)0.5ml；B组为荷HO-8910组：HO-8910 细胞1×106个/ 只；C组为人免疫重建组：PBL细胞4×107个/只，进行免疫重建；D组为荷HO-8910免疫重建组：PBL细胞4×107 个/只，24h后腹腔注射HO-8910 细胞1×106个/只，观察各组小鼠的生物学及免疫学特性。［结果］免疫重建鼠的骨髓、肝脏、脾脏、胸腺、淋巴结、外周血、腹腔液中检测到人源性细胞；荷HO-8910细胞免疫重建组小鼠移植瘤体积小于荷HO-8910组小鼠；各组均无移植物抗宿主病(GVHD)发生。［结论］初步建立免疫重建荷人卵巢癌-SCID鼠模型，为卵巢癌治疗的临床前研究提供了理想动物模型。

   【关键词】  卵巢肿瘤　SCID小鼠　疾病模型　动物

    Establishment of Hu-PBL-SCID Mice Model of Ovarian Carcinoma

    ZHAO Wei-dong, ZHANG Ai-jun, LING Bin, et al.

    (Anhui Provincial Hospital, Key Laboratory of Molecular Medicine of Anhui Province, Hefei 230001, China)

    Abstract: ［Purpose］ To investigate the feasibility of establish a human ovarian carcinoma model in human lymphocyte-engrafted to severe combined immunodeficient (hu-PBL-SCID) mice. ［Methods］ Sixteen SCID mice were randomly divided into 4 groups: group A with intraperitoneally phosphate buffered saline(0.5ml each mouse), group B with human ovarian carcinoma cells HO-8910(1×106 each mouse), group C with human peripheral blood lymphocyte(PBL) (4×107 each mouse) for immune reconstruction, and group D with PBL(4×107 each mouse) and HO-8910 (1×106 each mouse) cells. The biological and immunological features of each groups were evaluated. ［Results］ Human immunological cells were detected in bone marrow, liver, spleen, thymus, lymphoid node, peripheral blood and peritoneal fluid of hu-PBL-SCID mice. The volume of tumor were less in the reconstruction of human immunsystem group. No graft-versus-host disease(GVHD) was found in all groups. ［Conclusion］ A human ovarian carcinoma model has been established in hu-PBL-SCID mice which is an ideal animal model for preclinical research and treatment for ovarian carcinoma.

    Key words: ovarian neoplasms; mice, SCID; disease model, animal

    卵巢恶性肿瘤发病率占妇科恶性肿瘤第3位，而其死亡率却位居首位，对卵巢癌的研究已成为妇科恶性肿瘤主要的研究方向。本研究通过建立免疫重建荷人卵巢癌严重联合免疫缺陷(SCID) 鼠模型，观察其生物学、免疫学特性，为进一步研究卵巢癌的生物学行为，寻找新的、更有效的免疫治疗方法提供一种更能模拟人体免疫环境下的荷瘤动物模型。

    1 材料与方法

    1.1 材 料

    SCID鼠： 购自中山医科大学实验动物中心，雌性，4~5周龄，体重20g~25g，共16只。在本实验室屏障系统内饲养，一切进入屏障系统的人、动物、饲料、水、空气、铺垫物及各种用品均须经过严格的微生物控制。

    肿瘤细胞系： 人卵巢癌细胞系HO-8910购自中科院上海细胞所。

    人外周血淋巴细胞(PBL)：来源于健康女性志愿者的外周静脉血，由我院血库提供。

    试剂及仪器： RPMI-1640培养基购自美国GIBCO公司，淋巴细胞分离液购自上海华精生物有限公司，鼠抗人单克隆抗体CD3-CY、CD19-FITC、HLA-ABC-PE购自BD PharMingen 公司，流式细胞仪购自美国Becton Dickinson公司。

    1.2 方 法

    1.2.1 细胞培养

    HO-8910细胞培养于RPMI-1640完全培养基（10％热灭活新生牛血清），置于37℃、5％CO2孵箱中培养，根据细胞生长状态换液传代。HO-8910细胞是贴壁细胞，传代及试验前需用0.25％胰蛋白酶溶液消化。

    1.2.2 分离人外周血淋巴细胞(hu-PBL)

    用淋巴细胞分离液按常规方法分离后，PBS 液悬浮细胞并计数，调整细胞浓度为8×107/ml。

    1.2.3 动物分组、肿瘤移植及免疫重建

    A组即空白组：磷酸盐缓冲液( PBS)0.5ml；B组即荷HO-8910 组：HO-8910 细胞1×106个/只；C组即免疫重建组：PBL 细胞4×107个/只，进行免疫重建；D组即荷HO-8910细胞免疫重建组：PBL 细胞4×107 个/只，24h 后注射HO-8910 细胞1×106个/只。所有动物在移植前采用6MV X线直线加速器一次性全身照射，剂量率为150cGy/min，总剂量为300cGy。所有的细胞均悬浮在PBS0.5ml 中，HO-8910细胞皮下注射于NOD/SCID鼠左侧腋下，PBL 细胞经腹腔注射。

    1.2.4 各组荷瘤SCID鼠的生物学、免疫学特性观察

    (1)生物学特性：荷瘤鼠生长情况观察：荷瘤后观察各组鼠行为、营养状态等改变,若28d后仍生存，摘眼球取血处死。大体检查：处死SCID鼠后进行解剖，肉眼观察移植瘤生长表面形态、直径、质地、活动度情况。组织学观察：移植肿瘤及各脏器石蜡包埋、切片、HE染色，在光学显微镜下行组织学检查。

    (2)免疫学特性：小鼠颈椎脱臼处死，取小鼠肝、脾、胸腺、淋巴结、外周血、腹腔液细胞悬液测定人CD3、CD19、HLA-ABC阳性细胞比例。移植物抗宿主疾病(GVHD)情况：主要脏器如肝脏、脾脏、结肠等组织HE染色，GVHD诊断标准参照文献[1]。

    2 结 果

    2.1 荷瘤SCID 鼠生物学特征

    所有小鼠生存期均大于28d，荷HO-8910组小鼠出现不同程度的行为迟钝，目光呆滞及消瘦。荷HO-8910免疫重建组小鼠与荷HO-8910 组小鼠相比，在28d内未出现明显的行为及生活习性的改变。

    2.2 成瘤情况

    荷HO-8910组和荷HO-8910免疫重建组成瘤情况均为4/4，空白组及免疫重建组小鼠都未见肿瘤征象。荷HO-8910组小鼠于接种后15d～20d在注射部位出现瘤结节，并逐渐增大。移植瘤呈椭圆形、灰白色、质硬，部分有坏死，直径约1cm～2cm。荷HO-8910免疫重建组皮下肿瘤体积较荷HO-8910组明显缩小。

    2.3 荷瘤SCID 鼠肿瘤组织学特征

    移植后的肿瘤组织细胞镜下表现为核大、深染、核质比例大、核分裂多见，这些肿瘤细胞形成大小不等的癌巢，以肿瘤实质为主，周缘有少量纤维结缔组织（图1）。

    2.4 荷瘤SCID 鼠免疫学特征

    2.4.1 免疫重建后SCID 鼠人源性细胞检测

    外周血移植4周后，采用人特异单克隆抗体CD3-CY、CD19-FITC、HLA-ABC-PE测定小鼠肝脏、脾脏、胸腺、淋巴结、外周血、腹腔液、骨髓的人源性细胞情况。结果显示肝脏CD3+细胞占15.33%~28.75%、HLA-ABC阳性细胞占16.65%~31.98%，脾脏CD3+细胞占3.54%~5.27%、HLA-ABC阳性细胞占4.23%~5.36%，淋巴结CD3+细胞占4.86%~5.07%、HLA-ABC阳性细胞占5.38%~5.46%，外周血CD3+细胞占2.43%~6.10%、HLA-ABC阳性细胞占4.23%~6.68%，腹腔液CD3+细胞占25.35%~51.23%、HLA-ABC阳性细胞占71.85%~87.20%，胸腺CD3+细胞6.25%~9.16%、HLA-ABC阳性细胞占6.10%~9.04%，骨髓CD3+细胞、HLA-ABC阳性细胞所占比例<1%。各器官组织中CD19+细胞比例<1%，见表1。

    2.4.2 脾 重

    荷瘤28d后处死鼠,称量平均脾重，空白组为87.36±12.43g，荷HO-8910组为160.63±17.04g，免疫重建组为102.57±14.13g，荷HO-8910免疫重建组为410.68±31.50g。

    2.4.3 荷瘤SCID 鼠移植物抗宿主病(GVHD) 情况

    所有移植组SCID小鼠体重无明显变化，无皮疹，主要脏器如肝脏、脾脏、结肠等组织无明显GVHD表现。

    3 讨 论

    SCID 小鼠是1983 年Bosma 首次报道的一种以细胞和体液严重联合免疫缺陷为特征的近交系小鼠。目前已有大量人类肿瘤移植到SCID小鼠的报道，并证实SCID 小鼠比裸鼠更适合于诸多人类肿瘤生长、转移研究[2，3]。同时SCID小鼠可以用人类的有关细胞进行免疫功能重建，适合于在动物体内研究人类免疫细胞和人类肿瘤的关系，是极佳的活体测试系统[4] 。

    近年来，国内外相继出现荷人卵巢癌SCID 鼠模型，但由于这种模型缺乏细胞和体液免疫、不能真正反映人体内的荷瘤状态，而SCID小鼠既可携带人类肿瘤，又可用人类淋巴细胞进行免疫功能重建，因此有可能是较理想的免疫治疗临床前实验的动物模型。目前免疫重建的材料有多种：包括人胎儿胸腺、胎肝或胎骨、成人的外周血造血干细胞、成人外周血淋巴细胞等[5，6]，免疫重建的途径也分为静脉与腹腔注射，其中以外周血淋巴细胞腹腔移植最有实用价值。因此本研究建立免疫重建荷人卵巢癌SCID鼠模型，在小鼠肝、脾、胸腺、淋巴结、外周血、腹腔液中均可检测到人源性淋巴细胞，表明淋巴细胞免疫功能已建立。免疫重建后SCID小鼠脾脏重量有增加趋势，提示脾重的增加可能也是免疫重建成功的标志之一。对主要组织器官进行组织学检查，发现其组织结构和细胞形态未见明显改变。因此，我们认为已建立了免疫重建荷人卵巢癌SCID鼠模型。

    文献报道影响免疫重建效果的因素主要有：①SCID小鼠的个体差异。②SCID小鼠重建前的预处理。在重建前用γ射线全身体外照射和（或）注射抗鼠NK细胞的单抗可获得短期内更好的重建效果。③供者因素。个体差异使重建效果不同，同一供者的不同组织重建效果也不同。④淋巴细胞重建的数量。一般认为3×107~5×107重建效果好，细胞过少难以达到重建效果，细胞过多又易引起移植物抗宿主疾病。

    由于卵巢癌发病的诱发因素尚不明确，在动物体内不容易经诱发建立模型，故较多采用异种移植性肿瘤模型。所用的移植物主要有卵巢癌手术组织标本及卵巢癌细胞株培养细胞。主要的移植方法包括皮下移植、腹腔接种、原位移植及静脉接种等[7] ，目前多采用前两者。本研究结果提示免疫重建后小鼠机体内的免疫系统对肿瘤组织有一定的杀伤作用，可能会诱导肿瘤细胞的自身凋亡。

【参考文献】[1] Williamson LM,Warwick RM. Transfusion-associated graft-versus host disease and its prevention[J]. Blood Rev,1995,9:251-261.

[2] Lee CH, Xue H, Sutcliffe M, et al. Establishment of subrenal capsule xenografts of primary human ovarian tumors in SCID mice: potential models[J]. Gynecol Oncol, 2005,96(1):48-55.

[3] Gyory F, Mezosi E, Szakall S, et al. Establishment of the hu-PBL-SCID mouse model for the investigation of thyroid cancer[J]. Exp Clin Endocrinol Diabetes, 2005, 113(7):359-364.

[4] 崔恒, 李艺, 童春容,等. 免疫重建荷人卵巢癌严重联合免疫缺陷小鼠模型的建立[J]. 北京医科大学学报,2000, 32:488-491.

[5] Jackson DJ, Elson CJ, Kumpel BM.Reduction of human anti-tetanus toxoid antibody in hu-PBL-SCID mice by immunodominant peptides of tetanus toxoid[J]. Clin Exp Immunol, 2004,137(2):245-252.

[6] Beaman MH, Remington JS, Meyer DJ. Human peripheral blood lymphocyte severe combined immunodeficiency (hu-PBL SCID) models of toxoplasmosis[J]. Immunol Cell Biol, 2000,78(6):608-615.

[7] Xu Y, Silver DF, Yang NP, et al. Characterization of human ovarian carcinomas in a SCID mouse model[J]. Gynecol Oncol, 1999,72 :161-170.