通用型肿瘤抗原的特性及应用

    作者：李兴华 综述　 刘民培 审校    作者单位：沈阳军区总医院全军神经医学研究所实验室，辽宁 沈阳 110016

    【摘要】 通用型肿瘤抗原是新近报道的一类只在绝大多数肿瘤细胞的癌变全过程中表达，而在正常组织中无表达的肿瘤抗原。以这类新抗原制备的广谱抗肿瘤疫苗可用于多种癌症的免疫治疗。文章对目前已鉴定的四种通用型肿瘤抗原的主要特性及其应用作一综述。

    【关键词】 通用型肿瘤抗原　端粒酶反转录酶　基因　survivin　基因，mdm2　细胞色素p4501B1

　Characteristics and Application of Universal Tumor Antigens

    LI Xing-hua, LIU Min-pei

    (Neuromedical Institute of PLA, General Hospital of Shenyang Military, Shenyang 110016, China)

    Abstract:Universal cancer antigen is a newly reported tumor antigen, which expressed at the whole process in majority cancer cells, but not in the normal tissues.The broad-spectrum cancer vaccine prepared with the new antigens can be used as immunotherapy for many cancers. The characteristics and application of four verificated universal cancer antigens is reviewed in this article.

    Key words: universal tumor antigens; human telomerase reverse transcriptase; genomic,survivin;

    genomic,mdm2; cytochrome p450 isoform 1B1

    1 通用型肿瘤抗原的生物信息学

    肿瘤抗原被宿主免疫系统的效应细胞和效应分子识别，是进行免疫治疗的基础。一般用于制备肿瘤疫苗的多肽表位都是特异性的，不能被用于其他的原发性肿瘤。免疫选择所导致的抗原变异性缺失，是另一个使绝大多数已知的肿瘤抗原表位很难应用于临床的原因。近年来的研究发现，一类全新的通用型肿瘤抗原（universal tumor antigens，UTA）几乎表达于所有的肿瘤细胞，而在正常组织不表达，并可直接导致肿瘤的恶性表型[1]。UTA在体外可被特异性MHC限制的T细胞识别并诱导抗肿瘤应答，同时可以有效地解决肿瘤免疫逃避的难题。更重要的是，UTA的下调或缺失会对肿瘤细胞的生长造成严重的负面影响。由于UTA表达于不同的肿瘤细胞，其表位可以作为重要而广泛的应用性靶目标，在抗肿瘤免疫治疗中发挥重要的作用。

    与传统肿瘤抗原不同，UTA多通过“反向肿瘤免疫学”（reverse tumor immunology）的方法进行鉴定，即通过计算机表位预测对候选多肽进行初步筛选，然后对待检抗原进行MHC结合表位的预测，最后以正常受试者和病人的特异性CTL反应和功能检测进行最终的评价和鉴定[2]。基因组学的突破为鉴定肿瘤限制基因提供了极大的方便，并结合计算机技术，应用于癌症基因组剖析计划(The Cancer Genome Anatomy Project，CGAP)。目前，已被纳入CGAP的目的基因包括来源于30 000多种肿瘤细胞和正常文库的6 000多条基因。目的基因被鉴定后，接着对其表达蛋白进行分析。然后，应用表位推断技术可以预测肽段与MHC分子结合的亲合力。通过一套完整、严格的技术和标准，一种蛋白质一次至少可以鉴别10个以上的表位[3]。目前，已鉴定的通用型肿瘤抗原主要有端粒酶反转录酶(telomerase reverse transcriptase，hTERT), 凋亡抑制蛋白—存活素（inhibitor of apoptosis—survivin），p53作用蛋白mdm2（p53-interacting protein—murine double minute 2，mdm2）和细胞色素p4501B1（cytochrome P450 isoform 1B1，CYP1B1）等。

    2 已鉴定的通用型肿瘤抗原

    2．1 hTERT

    hTERT是端粒酶复合物的核心成分之一，其表达状态是细胞调控端粒酶活性的重要环节。人类hTERT是一单拷贝序列基因，定位于5q15.33。该基因总长度超过37kb，由16个外显子和15个内含子组成。启动子在主要转录起始位点附近及上游有一约400bp的负调控区，其中含有多个锌指蛋白-2 (myc-associated zincfinger protein，MZF-2)特异结合位点，这些位点的突变可明显增强hTERT的转录，过度表达MZF-2则抑制hTERT的转录水平[4]。

    端粒酶在人类85%以上的肿瘤中都有发现，可作为肿瘤诊断和判断预后的一种重要生物学标志物[5]。人工构建由hTERT启动子调控的，携带有caspase凋亡诱导基因的靶向基因治疗载体，只在端粒酶阳性的肿瘤细胞特异表达，因而可以诱导肿瘤细胞发生凋亡,但对正常细胞几乎没有影响[6]。

    2．2 Survivin

    Survivin属凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP）家族。人类survivin基因定位于17q25靠近端粒的位置，全长14.7kb，有3个内含子和4个外显子。该基因包括426个开放阅读框（open reading frame，ORF），编码142个氨基酸的蛋白质，分子量16.5kDa，其结构与IAP家族其它成员有所不同。一般IAP家族成员都具有2～3个串连的、高度保守的大约70个氨基酸残基的重复序列，即杆状病毒IAP重复序列(baculovirus IAP repeat,BIR)，羟基末端的锌指结构域以及caspase募集区，而survivin仅在3＇末端由3个α螺旋和3个β折叠组成一个BIR序列，此序列是survivin执行抗凋亡功能所必需的结构基础。BIR区后有一段较长的α螺旋，参与survivin在有丝分裂时对微管运动的调节作用。晶体结构分析表明，survivin蛋白以二聚体的形式存在，两个BIR区相互缠绕并弯成弓形，α螺旋区向外侧伸出，这种二聚体结构与其功能之间的关系尚不十分清楚。survivin与效应细胞蛋白酶受体1（effector cell protease receptor 1，EPR-1）基因序列高度互补，因此EPR-1可作为survivin的天然反义RNA而调控其表达[7]。

    基因表达系列分析（serial analysis of gene expression，SAGE）的结果显示，survivin在绝大多数肿瘤组织中呈高表达，而不存在于正常组织，且与肿瘤的恶性程度密切相关。在体外实验中，干扰survivin的功能会诱导肿瘤细胞凋亡，在体内则可导致小鼠原发性神经胶质瘤动物模型的肿瘤细胞死亡[8]。因此，以survivin作为肿瘤免疫治疗的靶点可以取得良好的治疗效果。通过构建HLA限制性survivin衍生的CTL表位用于肿瘤病人的免疫治疗，可显著降低发生肿瘤免疫逃避的风险[9]。RNA干扰及反义寡核苷酸等技术，都是通过基因水平下调survivin的表达，诱导肿瘤细胞发生凋亡，并可同时增强肿瘤组织对化疗药物的敏感性[10,11]。Survivin多肽序列的第34位苏氨酸，是p34cdc2的磷酸化位点。此位点的磷酸化是survivin发挥其抗凋亡功能所必需的。以丙氨酸取代34位苏氨酸的survivin突变体（T34A）转染神经胶质瘤细胞系U373和H4的实验结果发现，T34A突变体高表达的肿瘤细胞，其生长与对照组相比受到较明显的抑制，自发性凋亡明显增加。给予大剂量的caspase抑制剂不能降低细胞的死亡率，且凋亡诱导因子（apoptosis-inducing factor，AIF）的表达明显增强，提示其作用机制为非caspase依赖性[12]。另外，survivin 致敏树突状细胞（dendritic cell，DC）可显著刺激特异性CTL的活化增殖，并能有效抑制肿瘤细胞的生长[13]。

    2．3 mdm2

    mdm2基因最初从自发转化NIH3T3细胞的双微体（double minutes，DM）中被克隆出来，是一种高度扩增的原瘤基因。人类mdm2基因定位于12q13~14，核苷酸序列全长2.372kb。该基因进化上比较保守，在许多动物的染色体上都可以发现其同源序列。人类mdm2基因含有2个启动子，编码产生两种蛋白质p90和p76。p90是一种高度酸性的蛋白质，等电点极低，执行p53结合功能。p76缺乏p53结合位点，但可与p90结合并使之失活从而活化p53[14]。通过泛肽化(ubiquitination)降解p53有可能不是mdm2影响p53功能的惟一方式，也很可能不是mdm2的惟一功能。mdm2表达蛋白的结构分析表明，p90具有一个核定位信号结构域和两个锌指结构域，由此提示它还可能是一种DNA结合蛋白，有可能具有转录调节作用[14]，而这种结合的功能和意义尚有待于深入的研究。

    mdm2作为泛肽化蛋白连接酶—E3的配体(E3 ubiquitinligase)，通过泛肽化降解p53而发挥功能。因此，过高水平的mdm2可抑制p53的细胞周期停滞（cell cycle arrest）和诱导凋亡功能[14]。mdm2也可与另一种肿瘤抑制因子—ADP核糖基化因子（ADP ribosylation factors，ARF）结合，这将使mdm2与p53分离从而活化p53，将细胞周期阻断于G1期或G2/M转换期，或者诱导细胞凋亡。核辅阻遏物KAP1可与ARF竞争结合mdm2，从而促进mdm2与p53的结合，因此使p53失活[15]。mdm2在降解p53的过程中发挥着极为重要的作用。近年来的研究发现， mdmX、HAUSP（Herpesvirus-associated ubiquitin-specific protease）、ARF、COP1(consitiutive photomorphogenesis1)、Pirh2以及ARF-BP1等多种分子均参与p53的泛肽化降解过程。mdm2在绝大多数肿瘤细胞中扩增和过表达的机制也仍不清楚[16]。

    小分子mdm2抑制剂Nutlins，可诱导急性髓细胞样白血病(acute myeloid leukemia，AML)细胞的p53依赖性凋亡，表明以mdm2作为癌症治疗的靶点极具可行性[17]。同时，检测mdm2的扩增有可能成为判断多种肿瘤预后的指标[18]。

    2．4 CYP1B1

    CYP1B1是细胞色素p450家族成员。人类CYP1B1基因定位于2p21~22，全长12kb，有3个外显子和2个内含子。mRNA全长5.2kb，ORF从5＇端第二个外显子开始（而其他细胞色素p450家族成员的ORF都从第一个外显子开始），共1 629bp,编码543个氨基酸残基的酶蛋白。在3＇端较长的一段非转录区有三个多聚腺苷酸化位点。该基因只有一个单一的转录起始位点，并在启动子区缺乏TATA盒。其进化高度保守，大鼠、小鼠和人CYP1B1基因和蛋白质同源性超过80%。大鼠和小鼠CYP1B1 mRNA均为5.2kb，也编码543个氨基酸的功能相同的酶蛋白，但三者在代谢调节、作用的特异性和组织特异表达等方面各有所差异。组织化学染色显示，CYP1B1蛋白在超过95%的肿瘤中都显示阳性，而在相应的正常组织中则没有表达，机制尚不清楚。在环境致癌剂（如二恶英）所造成的肿瘤和人体内源性雌激素相关肿瘤（如乳腺和子宫肿瘤）的发生过程中，CYP1B1也起到一定的作用[19]。

    CYP1B1在多种肿瘤组织高表达，因此可作为重要的标志物用于肿瘤的早期诊断，并可能成为极好的肿瘤免疫治疗的靶目标。体外实验证实，CYP1B1特异性CTL可以杀伤多种肿瘤细胞，但对正常细胞无毒性作用。ZYC300是一种包被于生物可降解材料PDLC（poly-DL-lactide-coglycolide）微粒中的CYP1B1质粒DNA。其对不同肿瘤病人进行免疫治疗的Ⅰ期临床试验，也取得了一定的效果,并且受试病人没有出现明显的不良反应[20]。

    3 通用型肿瘤抗原尚有待解决的问题

    迄今为止，在UTA领域里所取得的研究成果令人鼓舞，并有可能为肿瘤的免疫治疗带来广阔的应用前景。但仍需进一步研究的问题是：①UTA在不同肿瘤细胞中表达的相关机制；②肿瘤基因的变异对UTA瘤苗产生的影响；③将UTA瘤苗导入人体也面临一定的技术难题，如前述的RNA干扰技术，虽然目前已能有效地将siRNA导入体外培养的细胞，但在应用于人体时，其稳定性较差；④将UTA瘤苗导入人体后，可能诱发机体的免疫应答而被降解。因此，构建更加稳定的投放载体仍有待解决；⑤UTA肿瘤疫苗的疗效和安全性问题尚待进一步的验证。尽管如此，制备以UTA为基础的广谱抗肿瘤疫苗，仍是在肿瘤免疫治疗中值得深入探讨的一种新策略。

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