XRCC1基因多态性与膀胱癌关系的病例对照研究

作者:张薇,项永兵,程家蓉

作者单位：1.上海交通大学肿瘤研究所 上海市肿瘤研究所，上海 200032　 2.University of Soutern California, Los Angeles, CA 90089,9176, USA           【摘要】  　　［目的］ 探讨人类DNA修复基因XRCC1 Arg194Trp单核苷酸多态性与膀胱癌危险性的关系。［方法］采用PCR,RFLP分析技术检测242例膀胱癌患者及225例人群对照XRCC1基因 194位点的多态性。应用非条件Logistic回归模型，调整混杂因素后,分析各基因型与膀胱癌发生的关系以及是否与吸烟因素存在着交互作用。［结果］ 膀胱癌病例组的194Trp/Trp突变基因型频率（11.2%）显著高于对照组(4.0%)。调整年龄、性别、吸烟、高危职业史、膀胱感染和体质指数等因素后，携带194Trp/Trp基因型个体患膀胱癌的风险是194Arg/Arg基因型个体的3.64倍(95%CI：1.60～8.30)。此基因型与吸烟对增加膀胱癌发病风险无明显交互作用。去除了吸烟的混杂效应后，194Trp/Trp基因型个体患膀胱癌的危险性是其它基因型个体的3.16倍(95%CI：1.45～6.88)。［结论］ XRCC1基因194Trp/Trp突变基因型增加膀胱癌发病风险，与吸烟无交互作用。

    【关键词】  膀胱肿瘤　病例对照研究　XRCC1　单核苷酸多态性　吸烟　流行病学

　　 Abstract: ［Purpose］ To investigate the relationship between the codon 194 arganine to tryptophan substitution polymorphism of X,ray repair cross complementing group 1 (XRCC1) and bladder cancer risk in a population,based case,control study. ［Methods］ A polymerase chain reaction,based assay was used to detect Pvu Ⅱ restriction fragment length polymorphisms in 242 patients with bladder cancer and 225 healthy controls. After adjusted for age, sex, smoking, high risk occupation, bladder infection and body mass index, interaction effects of the genotypes and bladder cancer risk was estimated using unconditional Logistic regression. ［Results］ The frequency of XRCC1 codon 194Trp/Trp genotype in the case group (11.2%) was significantly higher than that in the control group (4.0%). The individuals carrying 194Trp/Trp genotype had a significantly increased risk for bladder cancer (OR=3.64, 95%CI: 1.60～8.30). There was no evidence of interaction between XRCC1 codon 194Trp/Trp genotype and tobacco smoking. Mantel,Haenszel stratified analysis revealed that the individual carrying 194Trp/Trp genotype was associated with a significant increased risk for bladder cancer (adjusted OR=3.61, 95%CI:1.45～6.88) compared those with 194Arg/Arg genotype. ［Conclusion］ The genotype of XRCC1 194Trp/Trp might be associated with the risk of bladder cancer, but the genotype might not interact with tobacco smoking to increase the risk of bladder cancer.

    Key words: bladder neoplasms; case,control study; XRCC1; polymorphism; cigarette smoking; epidemiology

    膀胱癌是我国常见恶性肿瘤之一，多发于男性。2001年上海市区膀胱癌新发病例569例，男、女性世界标化发病率分别为8.12/10万和2.20/10万[1]。吸烟是膀胱癌病因中最重要的因素，吸烟者罹患膀胱癌的危险性是不吸烟者的2～4倍，且随着每日吸烟量的增加、吸烟年限的延长、开始吸烟年龄的提前和烟雾吸入深度的增加而增加。估计25%～60%男性膀胱癌和20%～32%女性病例可归因于此。另一个已知的病因是职业性接触某些芳香胺[2]。

    最近的研究显示，XRCC1基因多态性与头颈部、肺、食管、胃、结肠、胰腺、膀胱以及前列腺癌等肿瘤的风险相关[3~14]。但在膀胱癌方面少见详细报道。本研究在以往病例对照研究的基础上，进一步探索X射线损伤修复交叉互补基因1（X,ray repair cross complementing group1，XRCC1）Arg194Trp单核苷酸多态性对膀胱癌发生的可能影响，并探讨吸烟因素与基因多态的交互作用对患癌风险的影响。

    1 材料与方法

    1.1 研究对象

    通过上海市肿瘤登记处的发病登记，共访问到上海市区膀胱癌新病例608例和人群对照607例，具体调查方法及变量定义详见文献[15]。按照知情同意原则，调查人员在家访时预约抽取外周静脉血15ml，置于含有肝素抗凝血的采血管内，并于6h内放保温袋送至实验室登记，初步处理后置于-70℃低温冰箱保存，直至DNA抽提。病例组与对照组的采血率分别为87.2%和87.6%。本次研究从中抽取250对病例和对照血样进行XRCC1 Arg194Trp基因型测定，最终成功获得XRCC1 Arg194Trp基因型467 例（病例组242例，对照组225例）。

    1.2 基因型分析

    基因组DNA提取应用Promega公司DNA提取试剂盒。用Beckman公司640分光光度计进行DNA定量及纯度分析。用聚合酶链反应—限制性片段长度多态性分析技术（PCR,RFLP）检测研究对象的XRCC1 Arg194Trp基因型。XRCC1全基因序列来自基因库，所用引物序列为5′,GCC AGG GCC CCT CCT TCA A,3′和5′,TAC CCT CAG ACC CAC GAGT,3′，扩增片段为485bp。PCR反应体积50μl: 内含0.1μg模板DNA，0.6μmol/L各引物，0.2mmol/L dNTPs，2.0mmol/L MgCl2，2.0U Taq聚合酶及l×反应缓冲液。PCR反应条件为：94℃预变性4min后，于94℃变性35s，60℃退火40s和72℃延伸1min进行35个循环，最后72℃延伸4min，4℃保存。取5μl含Arg194Trp的PCR产物与限制性核酸内切酶Pvu Ⅱ于37℃温育过夜。酶切产物于2%琼脂糖凝胶电泳分析。如图1所示，第194密码子C→T突变后可被Pvu Ⅱ识别，酶切产物有396bp和89bp两个片段；杂合子则产生485bp，396bp和89bp三个片段，而野生型只有485bp一个片段。

    1.3 质量控制

    现场调查的质量控制详见文献[15]。实验室质量控制如下：实验采用双盲法进行。实验前，先抽取一部分样品进行预实验，充分估计实验中可能遇到的问题。实验过程中严格遵守实验操作规程预防交叉感染。为确定实验的可靠性，设立阳性阴性对照，随机抽取10%样品进行重复实验，并随机抽取两个样品测序证实其真实性（见图2）。

 1.4 统计分析

    设计Access数据库进行原始数据输入，资料的整理与分析采用SPSS 11.5统计软件包。采用χ2检验比较各基因型在病例与对照以及人口学特征、不同吸烟状况等分布的差异。以比值比(odds ratio, OR)及其95%可信区间(confidence interval, CI)表示各种基因型与膀胱癌危险的相关性。所有的检验均为双侧概率检验，检验水准α=0.05。

    2 结 果

    2.1 病例组和对照组均衡性

    检验进入分析的病例组和对照组分别为242例和225例，研究对象的人口学特征和相关危险因素见表1。病例组与对照组在性别、年龄、教育程度、婚姻状态和出生地等方面的均衡性较好（P＞0.05），但与对照组相比，病例组吸烟、有膀胱感染史及高体质指数的比例较大，虽然未发现年龄和职业因素在病例和对照组间的分布有显著性差异，但这两者与膀胱癌的发生关系较密切，为了避免混杂因素对结果产生影响，在随后分析中调整了性别、年龄、吸烟、高危职业、膀胱感染和体质指数。

    2.2 XRCC1 Arg194Trp基因型分布

    对照人群XRCC1 194Arg/Arg，Arg/Trp和Trp/Trp基因型频率分别为51.6%，44.4%和4.0%，而膀胱癌病例组分别为44.2%，44.6%和11.2%，差异有显著性（χ2=9.064，P=0.011）。研究人群194Trp和194Arg等位基因频率分别为33.5%和66.5%，经遗传平衡检验，Arg194Trp位点各基因型的分布符合Hardy,Weinbery遗传平衡定律（χ2=1.749，P＞0.05），表明样本具有良好的代表性。

    2.3 XRCC1 Arg194Trp基因型与膀胱癌的关系

    膀胱癌病例组的Trp/Trp突变基因型频率高于对照组。调整年龄、性别、吸烟、高危职业史、体质指数和膀胱感染等因素后，此基因型个体发生膀胱癌风险是Arg/Arg基因型个体的3.64倍(95%CI：1.60～8.30)。其中，男性携带Trp/Trp基因型个体发生膀胱癌风险是Arg/Arg基因型个体的3.26倍(95% CI：1.00～10.64)，女性相应的OR值为3.58（95%CI：1.07～11.96）。见表2。

    2.4 吸烟状况与XRCC1 Arg194Trp基因型的关系

    病例组与对照组吸烟状况不同(χ2 =7.256，P=0.007)，考虑吸烟是已确认的膀胱癌危险因素，故按个体的吸烟状况进行了分层分析。各层OR值分别为4.09倍(95% CI：1.43～11.70) 和2.31倍（95%CI：0.72～3.37）。一致性检验结果（χ2Breslow,Day=0.548，P=0.472）表明层间同质；分层卡方检验（χ2MH=8.237，P=0.004）提示去除了吸烟的混杂作用后，Trp/Trp基因型与膀胱癌的发生有关；合并ORMH=3.16(95%CI：1.45～6.88)，说明去除了吸烟的混杂效应后，Trp/Trp基因型个体患膀胱癌的危险性大约是其它基因型个体的3.16倍。见表3。

    为了评价XRCC1 Arg194Trp基因型是否与吸烟因素存在交互作用，我们将携带Arg/Arg基因型的不吸烟个体作为参比组，根据吸烟年限、吸烟支数、吸烟包年、是否吸入香烟烟雾分别进行了叉生分析。结果（表4）显示，调整年龄、性别、高危职业、膀胱感染和体质指数后，开始吸烟年龄大于25岁且携带Arg/Arg基因型个体罹患膀胱癌的危险性为参比组的1.07倍（95%CI：0.49～2.35），开始吸烟年龄小于25岁且携带Arg/Arg基因型个体罹患膀胱癌的危险性是参比组的2.27倍（95%CI：1.12～4.62），而开始吸烟年龄小于25岁且携带Trp/Trp基因型个体罹患膀胱癌的OR值是6.21（95%CI：1.18～32.81）。在其它吸烟因素叉生分析中也观察到相似结果，提示虽然膀胱癌的危险性随着吸烟水平的增加而增加，Trp/Trp基因型个体罹患膀胱癌的危险性可能更大。相乘模型交互作用检验结果未发现吸烟与XRCC1194Trp/Trp基因型有明显交互作用（P值均大于0.05）。

    3 讨 论

    膀胱癌的病因迄今尚未完全阐明，但许多流行病学研究结果显示吸烟、职业性接触某些芳香胺、泌尿系统感染等可能是引起膀胱癌的重要病因[2]。香烟中含有多环芳烃、芳香胺和N,亚硝基化合物等多种致癌物质，环境致癌物经代谢活化后产生的亲电子物质及细胞在生理或者炎症等病理状态下产生的反应活性物质(如氧自由基、脂质过氧化物、一氧化碳、亲电子烷化剂等)均可引起DNA损伤，如果这些损伤不能及时有效地修复，将导致基因不稳定性增加，诱发细胞癌变。DNA损伤修复是一个涉及许多酶和蛋白质参与的复杂过程，其中任何一个基因表达降低或功能缺陷都会影响相应的修复能力[16]。人类X射线损伤修复交叉互补基因1（X,ray repair cross complementing group 1，XRCC1）是一种重要的DNA修复基因，定位于19q13.2，它编码的蛋白质与DNA连接酶Ⅲ相互作用，修复DNA单链断裂，并与DNA聚合酶β一起进行碱基切除修复[17~19]。对人类XRCC1基因DNA序列分析的结果显示，存在三个会导致对应氨基酸发生变化的非保守性位点，它们分别是C26304T（Arg194Trp）、G27466A（Arg280His）和G28152A（Ars399Gln）[20]。其中，26304位点C→T的变异，可导致194密码子编码氨基酸Arg→Trp改变， 从位置上看，194密码子位于XRCC1蛋白质与DNA聚合酶β结合区域和与PARP结合区域之间，因此该变异可能改变XRCC1的功能，从而影响个体的肿瘤易感性。

    本研究显示上海市区人群的194Trp等位基因频率为26%，与已报道的中国河南林县（29%）[3]、江苏淮安（35%）[4]、台湾（27%）[5]及美国旧金山（25%）[20]等地区人群非常相近，高于文献报道的埃及人（5%）[6]、高加索人（6%）[7]和非洲裔美国人（5%）[8]。提示XRCC1基因Arg194Trp基因型存在着种族和地域的差异。

    本研究发现XRCC1 Arg194Trp单核苷酸多态与膀胱癌易感性的关系不受年龄、性别及吸烟、职业等因素的影响，说明194Trp等位基因是膀胱癌的独立危险因素。虽然吸烟是膀胱癌的危险因素，但本研究未发现XRCC1基因 Arg194Trp多态与吸烟有增加膀胱癌危险性的交互作用存在。本研究结果与部分相关研究报道的结果相符，如Xing等[3]检测了433例中国河南林县食管癌患者和524例正常对照XRCC1基因194Arg/Trp多态性，结果发现，携带194Trp/Trp基因型者发生食管癌的危险性比194 Arg/Arg或194Arg/Trp基因型增加2.07倍(95%CI：1.34～3.20)。Chen等[9]对中国人群109例肺癌患者和109例正常对照的研究发现，194Trp/Trp 基因型个体发生肺癌的相对危险性增加(OR=3.06，95%CI：0.94~9.92)。但也有资料显示XRCC1 194Trp等位基因与肿瘤风险无关[5,6,10～12]。甚至在某些研究中，得出的结论与本实验结果相反，即发现 194位点变异降低某些部位肿瘤的发病风险[4,8,13,14]，Stern等[13]对235例膀胱癌患者和213例对照人群的研究发现，至少携带一个194Trp变异基因型的个体与Arg/Arg纯合野生型相比，发生膀胱癌的相对危险性降低（OR=0.59，95%CI：0.3～1.0，P=0.06），此多态位点与吸烟无交互作用。Shen等[4]对188例胃癌患者和166例对照人群的研究发现,与Arg/Trp基因型和Trp/Trp基因型相比，Arg/Arg基因型患胃贲门癌的相对危险性显著增加(OR=1.86，95%CI：1.09～3.20)，提示Trp等位基因可能降低个体的胃贲门癌易感性。有关XRCC1单核苷酸多态性与肿瘤易感性关系的研究结果尚存在很大分歧，这一方面可能与研究对象的种族差异、环境暴露的差异、疾病种类有关，另一方面可能与样本量大小、对混杂因素的控制以及对修饰因素的分析等有关。

 本研究建立在以人群为基础的病例对照研究上，样本量较大，质量控制严格，研究中充分地考虑了可能混杂因素的影响，为XRCC1基因多态性与膀胱癌关系的评价提供了有价值的线索。但膀胱癌的发生是环境因素与遗传因素共同作用的结果，除了吸烟、职业等危险因素外，还涉及多种原癌基因的激活和许多抑癌基因的突变失活，就DNA修复基因本身而言，除了XRCC1外，还有XRCC3、XPD等，因此XRCC1基因194位点的多态性在膀胱癌中的作用有待于进一步研究。

【参考文献】  　　 [1] 上海市肿瘤研究所流行病学研究室. 2001年上海市区恶性肿瘤发病率[J]. 肿瘤, 2005, 25(6): 636.

[2] Silverman DT, Morrison AS, Devesa SS. Bladder cancer[A]. Schottenfeld D, Fraument JF Jr. Cancer epidemiology and prevention[M]. 2nd edition. New York: Oxford University Press, 1996. 1156-1179.

[3] Xing D, Qi J, Miao X, et al. Polymorphisms of DNA repair genes XRCC1 and XPD and their association with risk of esophageal squamous cell carcinomaina in a Chinese population[J]. Int J Cancer, 2002, 100(5): 600-605.

[4] Shen H, Xu Y, Qian Y, et al. Polymorphisms of the DNA repair gene XRCC1 and risk of gastric cancer in a Chinese population[J]. Int J Cancer, 2000, 88(4): 601-606.

[5] Lee JM, Lee YC, Yang SY, et al. Genetic polymorphisms of XRCC1 and risk of the esophageal cancer [J]. Int J Cancer, 2001, 95(4): 240-246.

[6] Abdel,Rahlnan SZ, Soliman AS, Bondy ML, et al. Inheritance of the 194Trp and the 399 Gln variant alleles of the DNA repair gene XRCC1 are associated with increased risk of early,onset colorectal carcinoma in Egypt [J]. Cancer Lett, 2000, 159(1): 79-86.

[7] Lunn RM, Langlois RG, Hsieh LL, et al. XRCC1 polymorphisms: effects on aflatoxin BI,DNA adducts and glycophorin A variant frequency [J]. Cancer Res, 1999, 59(11): 2557-2561.

[8] Sturgis EM, Casillo EJ, Li L, et al． Polymorphisms of DNA repair gene XRCC1 in squamous cell carcinoma of the head and neck[J]．Carcinogenesis, 1999, 20(11): 2125-2129.

[9] Chen S, Tang D, Xue K, et al. DNA repair gene XRCC1 and XPD polymorphisms and risk of lung cancer in a Chinese population [J]. Carcinogenesis, 2002, 23(8): 1321-1325.

[10] Butkiewicz D, Rusin M, Enewold L, et al. Genetic polymorphisms in DNA repair genes and risk of lung cancer [J]. Carcinogenesis, 2001, 22(4): 593-597.

[11] Olshan AF, Watson MA, Weissler MC, et al. XRCC1 polymorphisms and head and neck cancer[J]. Cancer Lett, 2002, 178(2): 181-186.

[12] Duell EJ, Millikan RC, Pittman GS, et al. Polymorphisms in the DNA repair gene XRCC1 and breast cancer [J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2001, 10(3): 217-222.

[13] Stern MC, Umbach DM, van Gils CH, et al. DNA repair gene XRCC1 polymorphisms, smoking, and bladder cancer risk [J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2001, 10(2): 125-131.

[14] David,Beabes GL, London SJ. Genetic polymorphism of XRCC1 and lung cancer risk among African,Americans and Caucasians [J]. Lung Cancer, 2001, 34(3): 333-339.

[15] 张薇, 项永兵, 邵常霞, 等. 吸烟和环境烟草烟雾与膀胱癌关系的病例对照研究[J]. 肿瘤, 2006, 26(155): 42-47.

[16] Wood RD, Mitchell M, Sgouros J, et al. Human DNA repair genes[J]. Science, 2001, 291(5507): 1284-1289.

[17] Kubota Y, Nash RA, Klungland A, et al. Reconstitution of DNA base excision,repair with punfied human proteins: interaction between DNA polymerase beta and the XRCC1 protein [J]. EMBOJ, 1996, 15(23): 6662-6670.

[18] Caldecott KW, Aoufouchi S, Johnson P, et al. XRCC1 polypeptide interacts with DNA polymerase beta and possibly poly (ADP,ribose) polymerase, and DNA ligase Ⅲ is a novel molecular′nick,sensor′ in vitro[J]. Nucleic Acids Res, 1996, 24(22): 4387-4394.

[19] Vidal AE, Boiteux S, Hickson ID, et al. XRCC1 coordinates the initial and late stages of DNA abasic site repair through protein,protein interaction[J]. EMBOJ, 2001, 20(22): 6530-6539.

[20] Shen MR, Jones IM, Mohrenweiser H, et al. Nonconservative amino acid substitution variants exist at polymorphic frequency in DNA repair genes in healthy humans[J]. Cancer Res, 1998, 58(4): 604-608.