人卵巢浆液性乳头状囊腺癌相关基因表达谱

　　作者：许沈华，牟瀚舟，朱赤红，钱丽娟，羊正炎，应晔，刘祥麟    作者单位：1.浙江省肿瘤研究所，浙江 杭州 310022；　2.浙江省肿瘤医院，浙江 杭州 310022

　　【摘要】［目的］ 探讨人卵巢上皮性癌与正常卵巢组织基因表达谱差异。 ［方法］ 采用基因芯片技术，按一步法分别抽提10例卵巢浆液性乳头状囊腺癌患者的癌组织和正常卵巢组织的总RNA并纯化mRNA；逆转录合成以Cy5荧光标记卵巢癌细胞和Cy3荧光标记正常卵巢上皮细胞的cDNA作为探针，在含有8 464点人类体细胞基因模板的表达谱cDNA芯片上进行杂交。用荧光扫描仪扫描芯片荧光信号图像，用计算机软件对扫描图像进行数字化处理分析。［结果］ 卵巢浆液性乳头状囊腺癌与正常卵巢上皮比较，差异5倍以上共有185个基因，其中表达上调(其荧光强度增强>5)有86个，表达下调(其荧光强度减弱<0.2)有99个。［结论］ 卵巢上皮性癌与正常卵巢上皮比较差异表达5倍以上的185个基因，可能与卵巢上皮癌的发生和发展有关。

　　【关键词】 卵巢肿瘤　cDNA微阵列　基因表达谱

　　The Gene Expressive Profile in Human Ovarian Papillary Serous Cystadenocarcinoma

    XU Shen-hua, MOU Han-zhou, ZHU Chi-hong, et al.

    (Zhejiang Cancer Research Institute, Hangzhou 310022, China)

    Abstract: ［Purpose］ To study the gene expressive differentia between human ovarian epithelial carcinoma and normal ovarian tissues. ［Methods］ A total RNA from 10 cases withovarian papillary serous cystadenocarcinoma and normal ovarian tissues were extracted by a single step method of gene chip. The cDNA retro?鄄transcribed from equal quantity mRNA derived from 10 cases with ovarian papillary serous cystadenocarcinoma and normal ovarian tissues. The cDNA strand was labeled with fluorescent Cy5(ovarian carcinoma cells) and Cy3(normal ovarian epithelial cells) as probes. The mixed probes were hybridized with BiostarH 8 464 dot human somatic cell gene. Fluorescent signals were scanned by laser scanner. The acquired image was analyzed by software with the digital computer. ［Results］ There were 185 genes expressive differentia more than 5 times between human ovarian papillary serous cystadenocarcinoma and normal ovarian epithelium. Among these genes, 86 up?鄄regulated (fluorescence intensity enhancement >5) and 99 down?鄄regulated(fluorescence intensity weakening <0.2). ［Conclusion］ One hundred and eighty?鄄five genes which expressive differentia in epithelial ovarian carcinoma tissues may related to oncogenesis and cancer developmant.

    Key words: ovarian neoplasms; cDNA microarray; gene expression profile本研究采用基因芯片技术研究卵巢上皮性癌与正常卵巢上皮基因表达谱差异，探索卵巢癌发生、发展过程中相关的基因群及其功能，为卵巢癌的诊断、治疗和预防提供分子标记和靶基因。

    1 材料与方法

    1.1 研究对象

    10例卵巢上皮性癌组织取自我院妇科卵巢癌患者手术标本。正常卵巢上皮取自因其它疾病切除卵巢的病人或者同一患者的正常卵巢上皮。取手术切除卵巢癌和正常卵巢上皮后立即冻存于液氮，另一半做病理切片。病理诊断：浆液性乳头状囊腺癌，高分化1例、中分化3例、中低分化3例、低分化3例。临床分期：Ⅱ期2例、Ⅲ期8例。正常卵巢上皮镜下观察均为正常卵巢上皮组织。

    1.2 cDNA芯片

    采用人类基因表达谱芯片（BiostarH?鄄80s ）由上海博星基因芯片有限责任公司生产。

    1.3 组织总RNA抽提和纯化

    用一步法分别提取癌细胞和正常卵巢上皮总RNA。将液氮中冻存的癌组织和正常卵巢组织取出后，立即分别置于研钵中，边加液氮边捣碎研细至粉末状，移入已加入三氨基甲烷(TRIzol)的匀浆管中，匀浆液离心后取上清液经1∶1的酚—氯仿两次抽提后经醋酸钠(NaAc)和酸性 5∶1酚—氯仿抽提，再经等体积异丙醇沉淀；离心后用无核糖核酸的Milli?鄄Q超纯水溶解、沉淀，采用紫外分光光度仪进行分析。用氯化锂(LiCl)沉淀方法纯化后，以紫外分光光度仪分析及电泳检测显示获得高质量的总RNA。采用Oligotex mRNA Midi 试剂盒 (Quagen 公司)分离纯化为mRNA。分别从每例取等量的mRNA混合。

    1.4 探针标记

    逆转录标记cDNA探针并纯化。用Cy3?鄄dCTP荧光标记正常卵巢上皮，用Cy5?鄄dCTP荧光标记卵巢癌细胞，乙醇沉淀后分别将探针混合（即Cy3?鄄dCTP对照+Cy5?鄄dCTP 卵巢癌）溶解在20μl杂交液中。

    1.5 杂交及洗涤

    （1）预杂交：预杂交液放入95℃水浴锅内变性2min，将点样的玻片放入95℃水浴锅内变性30s，取出后即放入无水乙醇中30s，晾干。将预杂交液加到玻片的点样区域内，加盖玻片，放入杂交箱内42℃预杂交5h～6h。（2）杂交：经预杂交的玻片用双蒸水冲去盖玻片。将探针置于95℃水浴中变性2min；玻片置于95℃水浴中变性30s，玻片取出浸入无水乙醇30s。将探针置于芯片上，加盖玻片，放入42℃杂交箱内杂交16h～18h。洗涤：去盖玻片用配制的洗涤液洗10min，室温晾干。

    1.6 荧光扫描和结果分析

    用ScanArray 4000 型（General Scanning 公司生产）荧光扫描仪扫描杂交芯片，获取基因表达的荧光信号强度值，用预先选定的40个内参照基因对Cy3和Cy5的原始获取信号进行均衡和修正。用Gene Pix Pro 3.0图像处理软件对扫描图像进行数字化处理，计算Cy3和Cy5两种荧光信号的强度和比值。

    判断基因差异表达的标准：（1）Cy3和Cy5信号的值皆大于200，或者其中之一大于800。（2）该基因点Cy5信号值/Cy3信号值的比值在0.1~10之间。

    2 结 果

    通过基因表达谱分析所得结果：卵巢上皮癌与正常卵巢上皮比较差异2倍以上（荧光强度增强>2或荧光强度减弱<0.5）的基因共有1 545个，由于基因较多，本文主要讨论差异5倍以上的185个基因，其中表达上调(荧光强度增强>5) 有86个，表达下调(荧光强度减弱<0.2)有99个。这些基因按功能分类见表1。

    本研究有12个差异表达基因与Xu等[1]报道在高转移人卵巢癌细胞系HO?鄄8910PM和其母系HO?鄄8910与正常卵巢上皮比较差异基因相同，其中有10个基因是同时上调或同时下调，但U72936 号基因在卵巢上皮癌是上调的，而在上述两株细胞系中都为下调；NM?鄄016039号基因在卵巢上皮癌是下调的，而在该两株细胞系都为上调,见表2 。

    3 讨 论

    癌的发生是一系列分子变化的结果，是许多肿瘤相关基因表达失常或许多肿瘤抑制基因失活所致。因此要了解整个癌变过程中的基因变化，需要研究的不是一个或几个基因，而是整个基因组在从正常到癌的各个阶段中上千个基因表达的动态变化。只有了解基因表达及水平才可能理解基因型和表型间的相互关系。基因芯片能大规模平行检测不同样品的基因表达差异，其最大的优点是改变了传统的一次实验仅能对单个或几个基因表达差异进行观察，因此在基因表达研究中得到越来越多的应用。检测卵巢上皮癌基因表达谱的变化不仅可以阐明在病理学变化的原因，也可提供对该疾病检测的新靶点和预防的机会,为人类卵巢上皮癌的基因诊断、治疗和预防提供新的科学依据。

    谷胱苷肽?鄄S?鄄转移酶(GSTs)是一组具有多种生理功能的同工酶家族，参与机体的二相解毒反应，催化体内许多有潜在毒性的化学药物、致突变剂、致癌剂和亲脂性化合物等，与还原型谷胱苷肽相结合使其毒性减低和水溶性增强，从而加强有害物质的清除，保护生物大分子免受侵袭。Xu等[1]的研究显示GST在高转移卵巢癌HO?鄄8910PM（0.3）下调比母系HO?鄄8910（0.45）低。Wang等[2]报道GST在卵巢癌下调（0.17）；本文GST也出现下调（0.37）；而Sakamoto等[3]报道GST在耐药卵巢癌细胞株上调。

    蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatase)参与多种激素（包括表皮生长因子、胰岛素、胰岛素样生长因子1等）介导的信号调控、能量代谢、细胞增殖和促进MHCⅠ类抗原表达。酪氨酸磷酸酶活性降低会使恶性细胞逃离免疫系统的监控。有报道酪氨酸磷酸酶在卵巢癌中出现下调[1，2]，而Sawiris等[4]报道酪氨酸磷酸酶在卵巢癌中出现上调。本文酪氨酸磷酸酶，受体型K、非受体型6、非受体型3均上调。

    波形蛋白(vimentin) 属于细胞骨架蛋白，它在细胞运动、分裂、信息传递、能量转换、代谢调控以及纤维细胞形态方面具重要作用。有报道波形蛋白在卵巢癌中表达显著下调[1，2]，与本文结果相同。

    锌指蛋白（zinc finger protein）是一个大的超家族。锌指蛋白发生异常就有可能发生肿瘤，有将C4HC3锌指结构称为白血病相关蛋白。有报道锌指蛋白在卵巢癌中下调[1，2]，而本文有19个锌指蛋白出现异常，其中上调有8个，下调有11个。

    丝氨酸/苏氨酸激酶15（serine/threonine kinase15，STK15）在细胞中起到调节中心体和细胞器的作用。Schraml等[5]报道STK15在55%卵巢癌是在染色体20 q区DNA 拷贝量增加。本文发现STK15表达上调。

    基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）是一组重要的细胞外基质降解酶，它们通过对细胞外基质中不同成分的降解，在肿瘤侵袭转移中起关键性作用。李新华等[6]报道在胃癌组织中MMP1、MMP2、MMP12均高表达，且在有淋巴结转移的肿瘤中呈显著高表达。Wang等[2]报道MMP7在卵巢癌显著上调。Stadlmann等[7]报道 MMP8表达水平与卵巢癌分级、分期和预后差有关。本文发现MMP2、MMP16上调，而MMP1下调。

    目前发现细胞周期蛋白（cyclin）家族有8大成员，分别命名为cyclin A、B、C、D、E、F、G、H。它们在G2/M转换点发挥重要的功能，与细胞分裂、凋亡相关基因、血管生长因子和受体、端粒酶等有关。Sawiris 等[4]报道在人卵巢癌 cyclin依赖激酶6上调和 cyclin依赖激酶 7 及 cyclinH下调。Sakamoto 等[3]报道耐药卵巢癌细胞株cyclin依赖激酶10上调。Xu等[1]报道在高低转移人卵巢癌细胞系CCNB1基因表达均显著上调，而CCN1基因下调。Barbieri 等[8]报道在cyclin D1高表达的卵巢癌预后较差。Lambros等[9]报道cyclin D1在卵巢癌细胞染色体11q13区扩增。本文发现有11个细胞周期蛋白出现异常，其中上调有5个（P15RS、 DMTF、CCNF、HMOX2、CCNB1）；下调有6个（CCND2、CCNH、P57，kip2、P27，kip1、CCN1、P21，cip1）。

    CD9 抗原属于细胞表面蛋白TM4超家族。有报道CD9 抗原在卵巢癌显著上调[2，3，10]本文也发现上调。而Furuya等[11]报道CD9下调的卵巢癌容易腹膜播散，患者预后差。

    基因芯片技术的应用是生命科学研究方法上的革命。这种系统、全面、综合的研究思维方式对今后生命科学研究将产生巨大的影响。

【参考文献】[1]Xu SH, Mou HZ, Lu GQ, et al. Gene expression profile differences in high and low metastatic human ovarian cancer cell lines by gene chip[J]. Chin Med J（Engl）, 2002,115（1）:36-41.

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