CD44v6和LYVE1蛋白在卵巢上皮性肿瘤中的表达及意义

作者：陈睿,汪蕊,杨婉华,马湘一,卢运萍,王世宣,马丁

作者单位：基金项目：国家重点基础研究发展规划项目（2002CB513100）；国家自然基金项目（30170976）　430030 武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院妇产科

    【摘要】  　　目的 探讨CD44v6和LYVE1蛋白在卵巢上皮性肿瘤中的表达及意义。方法 应用免疫组化链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶连接（SP）法检测CD44v6、和LYVE1在63例卵巢上皮性癌、5例卵巢良性上皮性肿瘤和4例正常卵巢组织中的表达情况。结果 正常卵巢组织、卵巢良性上皮性肿瘤和卵巢上皮性癌中CD44v6和LYVE1蛋白的表达具有显著差异；CD44v6表达强度与卵巢癌临床分期和组织学分级呈正相关，LYVE1的表达和卵巢癌的临床分期正相关，而不同组织学分级间差异无显著性；CD44v6和LYVE1的表达强度与淋巴结有无转移显著相关；CD44v6和LYVE1在卵巢癌中协同表达。结论 CD44v6和LYVE1在卵巢癌发生发展、和淋巴转移中起不同程度的作用，其检测可为卵巢肿瘤生物学行为判定提供参考依据。

【关键词】  卵巢上皮性肿瘤　CD44v6；LYVE1　免疫组织化学

　　Clinical Significance of Expression of CD44v6 and LYVE1 in Epithelial Ovarian Tumor

    CHEN Rui,WANG Rui,YANG Wanhua,MA Xiangyi,LU Yunping,WANG Shixuan,,MA Ding

    Department of Obstetrics & Gynecology,Tongji Hospital,Tongji Medical College,Huazhong           University of Science and Technology,Wuhan 430030,China

    Corresponding Author:WANG Shixuan,Email:wang_shixan@yahoo.com.cnAbstract：Objective   To determine the expression of CD44v6 and LYVE1 in epithelial ovarian tumor and its clinical significance.Methods  The expression of CD44v6 and LYVE1 was examined by immunohistochemical streptravidinbiothin peroxidase(SP) assay.The correlation between their expression and the clinicopathological features was analyzed.Results  The expression of CD44v6 and LYVE1 increased significantly in ovarian epithelial cancer compared to that in benign ovarian epithelial tumors and normal ovarian tissues.The expression of CD44v6 was positively associated with the FIGO stages and WHO grades of the patients with ovarian epithelial cancer.The expression of LYVE1 was significantly related to the stages.The expression of CD44v6 and LYVE1 was significantly associated with lymph node status.There was statistically significant correlation between CD44v6 and LYVE1.Conclusion  CD44v6 and LYVE1 played certain roles in oncogenesis,progression and lymphatic metastasis of ovarian cancer.

    Key words：Epithelial ovarian carcinoma;CD44v6;LYVE1;Immunohistochemistry

　　肿瘤的侵袭转移是个复杂多步骤过程，与肿瘤细胞的粘附、新生血管形成和淋巴道转移等有关。研究表明,细胞表面粘附分子CD44变异体主要表达于上皮源性细胞和肿瘤细胞,其中尤以CD44v6与肿瘤细胞浸润、转移趋势和不良预后密切相关[1]。LYVE1是淋巴管壁透明质酸(HA)的主要受体，且是肿瘤组织淋巴管形成的特异标志[2]。但CD44v6和LYVE1与卵巢癌的发生发展有无关系、是否存在协同作用，目前报道甚少。本课题应用免疫组织化学方法同时检测卵巢癌组织中CD44v6和LYVE1的表达情况，试图探讨它们与卵巢癌临床病理关系及其在卵巢癌发生发展中的作用。

   1材料与方法

    1.1材料

    收集2002～2004年华中科技大学同济医学院附属同济医院病理科保存卵巢上皮性癌标本63例，其中浆液性囊腺癌45例，粘液性囊腺癌18例，术前均未接受过化学治疗和放射治疗。临床分期按国际妇产科联盟（FIGO）2000年标准：I期12例、II 期18例、III期13例、IV期20例。根据WHO组织分级标准分级：I级17例、II级27例、III级19例。同期随机选取正常卵巢组织4例，卵巢良性上皮性肿瘤15例。

    1.2试剂

    鼠抗人CD44v6蛋白mAb为Bender公司产品，羊抗人LYVE1蛋白抗体购自美国santa cruz Biotechology Inc公司，SP试剂盒购自北京中山生物公司。

    1.3实验方法

    石蜡包埋标本，4μm连续切片，经微波抗原修复、血清封闭、一抗二抗孵育、进行免疫组化染色(SP法),抗体工作浓度1∶250。以磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗作为阴性对照，用CD44v6和LYVE1乳腺癌阳性片作阳性对照。

    1.4判定标准

    染色阳性表达为棕黄色，根据阳性细胞所占比例判定：阳性细胞<5%者为阴性(-)；5%～50%者为阳性(+)；＞50%者为强阳性(++)。

    1.5统计学处理

    应用SPSS11.0软件处理，根据数据来源和统计学要求采用χ2检验。

    2结果

    2.1CD44v6和LYVE1在不同卵巢组织中的表达

    CD44v6染色主要存在于细胞膜；LYVE1 染色主要存在于细胞浆，细胞膜亦有部分染色，见图1。CD44v6和LYVE1在卵巢上皮性癌组织中的表达均明显高于卵巢良性肿瘤和卵巢正常组织，差异具有显著性，P均<0.05，见表1。表1CD44v6和LYVE1在不同卵巢组织中的表达

    2.2卵巢癌中CD44v6和LYVE1的表达及与临床病理学参数的关系

    CD44v6和LYVE1在卵巢癌不同年龄组间表达差异无显著性(P>0.05)。在卵巢癌I期、Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期不同临床分期中，CD44v6和LYVE1表达率明均显增高，且差异有显著性(P<0.05)，提示其表达与卵巢癌临床分期呈正相关。在卵巢癌高、中和低分化不同组织学分级间，CD44v6表达率分别为64.71%、85.19%及89.47%，在低分化癌的表达率明显高于高分化癌(P<0.05)。而LYVE1在不同组织学分级间表达的差异无显著性(P>0.05)。CD44v6和LYVE1在有淋巴结转移组中的表达率明显高于无淋巴结转移组，且差异有显著性意义,见表2。表2卵巢癌中CD44v6、LYVE1表达与临床病理学参数的关系

    2.3  卵巢癌中CD44v6和LYVE1蛋白表达的相关性

    CD44v6和LYVE1蛋白在卵巢癌中的表达经统计学分析，两者表达有相关性（P<0.05），见表3。表3CD44v6、LYVE1在卵巢癌中共同表达的相互关系

    3讨论

    3.1粘附分子CD44v6和卵巢癌

    CD44是广泛存在于细胞表面的一类糖蛋白，在人类，其基因定位于染色体11p13，至少由20个外显子构成，其中10个为组成型外显子，其余为V区变异拼接外显子。仅含有组成型外显子的CD44转录子称为标准CD44（CD44s），而在Ｖ区选择性插入变异性外显子的称变异型CD44（CD44v），V区外显子既能以连续方式拼接，也能以跳跃方式拼接，从而可得到众多同工型基因(CD44v1～CD44v10)，而CD44v6因与肿瘤侵袭转移关系密切而于近年受到高度重视。

    Stiskeler等[3]用敏感的酶联免疫吸附法检测卵巢癌患者血清中CD44v6含量与淋巴结转移的关系，结果显示，与无淋巴结转移的患者相比，淋巴结转移的患者血清中可溶性CD44v6含量明显升高。也有一些学者[4]发现恶性与良性卵巢肿瘤及正常卵巢组织相比，CD44表达失控，但却未发现任何一种CD44（包括CD44v6）与年龄、临床症状、肿瘤大小、激素受体状况、组织级别等临床诊断评价标准之间有明确的相关性。

 本研究发现CD44v6不仅在卵巢上皮性癌中表达水平明显高于较卵巢良性上皮性肿瘤及正常卵巢组织，差异具有显著性，而且表达强度与卵巢癌病理分期、组织学分级和淋巴结转移呈正相关，推断CD44v6与卵巢癌的发生、侵袭转移有关。CD44v6与卵巢上皮性癌分型、分化、分期之间的关系，我们可以通过比较CD44v6在卵巢上皮性癌不同病理类型间的表达差异，和不同分化、分期间CD44v6表达强度的差异来证实。如果这种关系得以明确，我们可通过癌组织CD44v6表达程度、所处FIGO分期来制定临床治疗方案。

    3.2LYVE1与卵巢癌

    Carla等[5]研究表明，LYVE1表达不仅局限于淋巴管，还表达于正常人肝血窦内皮细胞。Sanna等[6]研究表明在头颈部鳞状细胞癌中，肿瘤周边存在高密度的LYVE1阳性脉管提示较高的生存率。Sahni等[7]通过对恶性黑色素瘤的研究发现，LYVE1阳性仅能提示淋巴系统中存在黑色素瘤细胞，而不能说明肿瘤的转移。

    本研究用LYVE1单抗对正常卵巢组织，卵巢良性上皮性肿瘤及卵巢上皮性癌进行检测，各组间表达有明显差异。LYVE1与卵巢上皮性癌临床分期呈正相关而不同组织学分级间无明显差异。LYVE1表达与卵巢上皮性癌淋巴转移有关，临床上对卵巢癌及癌旁组织进行LYVE1检测，有助于肿瘤转移潜能的预测。

    3.3CD44v6与LYVE1协同表达意义

    在恶性肿瘤发生、发展和转移的各阶段，许多学者提出协同作用假说，认为至少有两个或两个以上功能不同的异常激活基因，各自发挥不同作用，并在时间和空间上相互配合协同促进细胞的癌变[8]。本研究发现，LYVE1在卵巢癌中的表达与CD44v6表达关系密切，且均与临床分期呈正相关，推测CD44v6和LYVE1在卵巢癌发生发展、侵袭、转移尤其是淋巴转移过程中存在协同作用。提示联合检测 CD44v6和LYVE1对判断卵巢癌的恶性程度及生物学行为是一项有意义的综合性指标。

    以上研究表明，CD44v6和LYVE1与卵巢癌的淋巴转移密切相关，其表达标志着肿瘤细胞具有较高淋巴转移潜能，而CD44v6和LYVE1表达阴性的肿瘤细胞，可能无淋巴转移能力或转移能力低下。对于上述推测，我们正通过对研究对象的跟踪随访，对患者长期生存率，肿瘤复发和转移情况进一步收集整理。如果我们的假说得到佐证，其意义在于，CD44v6和LYVE1可作为一种有效的肿瘤预后标志物，用以指导对卵巢癌患者的临床治疗。

【参考文献】  　　［1］ Chuang CK,Liao SK.Differential expression of CD44variant isoforms by cell lines and tissue specimens of transitional cell carcinomas [J] .Anticancer Res,2003,23(6C):4635.

［2］He Y,Karpanen T，et al.Role of lymphagiogenic fators in tumor metastasis［J］.Biochim Biophys Acta,2004,1654(1):312.

［3］Stickeler E,Vogl FD,Denkinger T,et al.CD44 splice variants and pelvic lymphnode metastasis in ovarian cancer patients［J］.Int J Mol Med,2000,6(5):595601.

［4］Sanchez Lockhart M,Hajos SE,Basilio FM,et al.Splice variant expression of CD44 in patients with breast and ovarian cancer［J］.Oncol Rep,2001,8(1):145151.

［5］Mouta C C,Nasser SM,Di Tomaso E,et al.LYVE1 is not restricted to the lymph vessels expression in normal liver blood sinusoids and downregulation in human liver cancer and cirrhosis［J］.Cancer Res,2001,61(22):80798084.

［6］Maula SM,Luukkaa M,Grenman R,et al.Intratumoral llymphatics are essential for the Metastatic spread and prognosis in squamous cell carcinomas of the head and neck region［J］.Cancer Res,2003,63(23):85558556.

［7］Sahni D,Robson A,Orchard G,et al.The use of LYVE1 antibody for detecting lymphatic involvement in patients with malignant melanoma of known sentinel node status［J］.J Clin Pathol,2005,58(7):715721.

［8］李鸣,于茂生,申鹏飞,等.联合应用CHaras、Cmyc 反义寡聚脱氧核苷酸对膀胱癌细胞生长增殖的抑制作用[J].中华外科杂志,1996,34 (1):79.