EB病毒潜伏膜蛋白(LMP1)与survivin在鼻咽癌中的表达

作者:陈军,陈发龙

作者单位：530021 南宁，广西医科大学附属肿瘤医院

  【摘要】  　目的 探讨鼻咽低分化鳞状细胞癌组织中EB病毒潜伏膜蛋白LMP1和survivin表达水平与预后的关系。方法 用免疫组化SP法对83例鼻咽低分化鳞状细胞癌组织进行LMP1和survivin标记，分析其与临床分期、放疗后三年内结果的关系。结果 LMP1的表达与临床分期无关（P＞0.05），但与放疗后三年内复发有关（P＜0.05）。survivin与临床分期，放疗后三年内复发有关（P＜0.05）。LMP1与survivin有相关（P＜0.05）。结论 LMP1与survivin在鼻咽癌的预后中有重要价值，可作临床治疗的参考指标。

【关键词】  鼻咽癌　LMP1;survivin　免疫组化

　　 Expressions of EpsteinBarr Virus Latent Membrane Protein 1(LMP1) and survivin in Nasopharyngeal Carcinoma and their Clinical Significance

    CHEN Jun,CHEN Falong

    Department of Pathology,The Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021,ChinaAbstract：Objective   To investigate the expression of EBVLMP1 and Survivin in nasopharyngeal poor differentiated squamous cell carcinoma and the correlation to prognosis.Methods  The expression of LMP1 and survivin were detected by the SP immunohistochemical method in 83 NPC patients,and analyzed the relationship of their expressions with clinical stage and result after radiotherapy in three years.Results  LMP1 was no correlation of clinical stage（P＞0.05）,but correlated with relapse after radiotherapy in three years（P＜0.05）.survivin was correlation of clinical stage and relapse after radiotherapy in three years（P＜0.05）.LMP1 and Survivn were correlation each other（P＜0.05）.Conclusion  LMP1 and survivin have important value for prognosis in nasopharyngeal carcinoma,and may be regarded as reference target in clinical therapy.

    Key words：Nasopharyngeal;Carcinoma;LMP1;survivin;Immunohistochemical method

　鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma，NPC）是我国常见的恶性肿瘤，尤以两广地区高发，随着对NPC研究的逐渐深入，EBV感染和人的NPC密切相关已得到公认。survivin是一种凋亡抑制因子，有研究表明survivin的表达程度与病期进展和肿瘤组织的恶性程度相一致。我们采用免疫组化的方法检测NPC中最常见的低分化鳞癌病理组织中LMP1和survivin的表达情况，结合临床分期、放疗后三年内是否复发等资料进行研究，以探讨两者在NPC中的作用、相互关系及其意义。

    1材料和方法

    1.1材料

    83例鼻咽低分化鳞癌标本均来自我院1998年1月～2002年1月收验的石蜡包埋组织。

    1.2分组

    NPC的临床分期按1992年福州全国鼻咽癌会议推荐标准[1]，将Ⅰ～Ⅱ期28例，Ⅲ期26例，Ⅳ期29例分为3组；按放疗三年内是否复发将病例分为未复发组48例和复发组35例两组。

    1.3免疫组化检测方法

    采用过氧化物酶标记的链霉卵白素染色法SP法。使用抗体均购于美国Santa Cruz公司产品，使用抗体的工作浓度：鼠抗人单克隆抗体LMP1 1:80，兔抗人多克隆抗体survivin 1∶100，SP试剂盒购于北京中山公司，整个过程按试剂盒说明书进行。用磷酸盐缓冲液（phosphatic buffered saline，PBS）代替一抗作阴性对照。

  1.4判断标准

    LMP1以癌细胞胞浆、胞膜呈黄棕色颗粒，survivin以癌细胞胞核和胞浆呈黄棕色颗粒,阳性细胞数＞5%为阳性标记。

    1.5统计学处理

    采用SPSS11.5软件，χ2检验。PEMS3.0软件，相关分析。P＜0.05有显著性差异。

    2结果

    2.1LMP1和survivin在鼻咽低分化鳞癌不同临床分期组别中的表达

    （1）LMP1在Ⅰ～Ⅱ期病例组28例中阴性表达见图1，阳性表达见图2，阳性率高于Ⅲ期病例组，低于Ⅳ期病例组。但LMP1在不同分期中的阳性率比较无明显差异。（2）survivin在Ⅰ～Ⅱ期病例组28例中阴性表达见图3，阳性表达见图4，阳性率低于Ⅲ期病例组和Ⅳ期病例组，Ⅰ～Ⅱ期组阳性率与Ⅲ期组、Ⅳ期组阳性率比较有统计学意义，Ⅲ期、Ⅳ期组阳性率比较无明显差异，见表1。表1 LMP1、survivin表达与NPC低分化鳞癌临床分期的关系注：LMP1在Ⅰ～Ⅱ期组的阳性率与Ⅲ期组阳性率的比较：χ2=0.0593，P=0.08075；Ⅰ～Ⅱ期组的阳性率与Ⅳ期组阳性率的比较：χ2=0.0128，P=0.9101；Ⅲ期组阳性率与Ⅳ期组的比较：χ2=0.1271，P=0.7215。survivin在Ⅰ～Ⅱ期组的阳性率与Ⅲ期组阳性率的比较：χ2=6.4803，P=0.0109；Ⅰ～Ⅱ期组的阳性率与Ⅳ期组阳性率的比较：χ2=7.9875，P=0.0047；Ⅲ期组阳性率与Ⅳ期组的比较：χ2=0.0458，P=0.83052.2LMP1在放疗后三年未复发的病例组中的阳性率低于放疗后三年内复发病例组，两者比较有统计学意义。survivin在放疗后三年未复发的病例中的阳性率低于放疗后三年内复发的病例组，两者比较有统计学意义，见表2。表2LMP1、survivin表达与放疗后三年有无复发的关系 注：LMP1在放疗后三年无复发组的阳性率与放疗后三年内复发组阳性率的比较：χ2=5.3989，P=0.0201。survivin在放疗后三年无复发组的阳性率与放疗后三年内复发组阳性率的比较：χ2=7.4532，P=0.0063。2.3LMP1与survivin在鼻咽低分化鳞癌中表达的关系见表3，两因素之间统计学处理有明显相关性。表3LMP1表达与survivin表达注：LMP1与Survivin两因素之间相关性分析：r=0.4960，P=0.0000                               

　　 3讨论

    细胞凋亡一直是肿瘤研究中的热点问题，它在肿瘤的发生、发展、治疗等方面都发挥着重要作用。LMP1是EB病毒潜伏感染时表达的一种重要转化膜蛋白，被确认为具有癌基因功能的蛋白质。Kawanish[2]、Komano[3]、Souza[4]等研究发现LMP1可以抑制H1299上皮、B细胞、Burkitt’s淋巴瘤细胞和Jurkat细胞等凋亡。survivin是1997年发现的一个凋亡抑制因子，属于凋亡抑制蛋白家族（IAPs），因其在胚胎组织和大多数肿瘤组织中呈高表达，而正常组织和癌旁组织不表达，故受到关注[5,6]。

    LMP1表达与临床分期的关系鲜有报道，本组实验表1显示在不同分期组中表达无明显差异说明了LMP1与鼻咽癌分期并无明显联系。survivin表达在Ⅰ～Ⅱ期组与Ⅲ期组、Ⅳ期组中有明显差异性，Ⅲ期组、Ⅳ期组中的表达明显高于Ⅰ～Ⅱ期组，Ⅲ期组与Ⅳ期组间无明显差异性，与齐卫卫[7]等人报道的survivin在Ⅰ～Ⅱ期NPC组织中的阳性率为33%，Ⅲ～Ⅳ期为79.2%的结果相近，这说明了survivin在与鼻咽癌的临床分期中密切相关。肿瘤的放射治疗主要是通过直接物理作用（坏死）和诱导细胞内基因表达（凋亡）促使肿瘤细胞死亡，其中诱导肿瘤细胞凋亡是肿瘤放射线治疗的重要机制之一[8]。Caspase3的活化是细胞凋亡的终末效应子，一旦活化，细胞凋亡进入不可逆阶段。放射线活化NFΚB拮抗肿瘤细胞凋亡可能与cIAP2表达和Crel活化有关[9,10]。唐发清等[11]用实验验证了LMP1能活化NFκB参与了鼻咽癌细胞拮抗放射治疗诱导的凋亡。本组表2中表明LMP1的表达与放疗后三年内的复发预后有着密切的相关，LMP1表达者，可能提示预后不佳。这从临床方面验证了唐发清等[11]人实验结果的可能性。survivin可直接作用于Caspase，主要抑制Caspase3、Caspase7的活性，阻断细胞的凋亡过程，也可通过p21间接抑制Caspase，阻止细胞凋亡[12]，Asanuma等[13]采用定量RTPCR检测survivin mRNA表达，发现survivin表达与放射治疗敏感性呈反比，survivin表达抑制放射线诱导Caspase活化；抑制survivin mRNA表达，可提高放射治疗的敏感性。本组表2中表明survivin的表达与放疗后三年内的复发有着密切的相关，临床方面的病例分析结果与前人的实验结果一致，survivin表达者提示放疗的效果欠佳，预后不好。而LMP1、survivin这两者间是否有相关联系呢？查阅国内相关文献，有唐发清等[14]提出EB病毒LMP1通过活化NFκB、AP1上调survivin表达。用NFκB抑制子IκB显性负性突变体和AP1（cJun）显性负性突变体分别抑制NFκB和AP1活化，可阻断LMP1上调survivin表达。表3显示，LMP1与survivin的相关性分析有统计学意义，从而在临床的病例分析中验证了两因素的相关性。

  通过上述分析，我们有理由认为，LMP1、survivin这两个因素可做为鼻咽低分化鳞癌的预后指标，提示LMP1、survivin可作为肿瘤治疗的分子靶，为提高肿瘤的放射照射治疗提供实验依据，成为肿瘤治疗的新的突破点。

【参考文献】  　　［1］ 夏云飞，钱剑扬，张思思，等.实用鼻咽癌放射治疗学[M].北京：北京大学医学出版社，2003.79.

[2]Kawanish M.Expression of Epsteinbarr virus latent membrane protein 1 protects Jurkat T cells from apoptosis induced by serum deprivation[J].Virology，1997，228（2）:244250.

[3]Komano J,Sugiura M,Takada K.EpsteinBarr virus contributes to the malignant phenotype and to apoptosis resistance in Burkitt's lymphoma cell line Akata[J].J Virol， 1998 ，72(11)：91509156.

[4]D'souza B，Rowe M，Walls D.The bfl1 gene is transcriptionally upregulated by the EpsteinBarr virus LMP1,and its expression promotes the survival of a Burkitt's lymphoma cell line[J].J Virol，2000，74(14)：66526658.

[5]Ambrosini G,Adida C,Altieri DC.A novel antiapoptosis gene,survivin,expressed in cancer and lymphoma [J].Nat Med，1997，3(8)：917921.

[6]Adida C,Crotty PL,Mc Grath J，et al.Developmentally regulated expression of the novel cancer antiapoptosis gene survivin in human and mouse differentiation[J].Am J Pathol， 1998，152(1)：4349.

[7]齐卫卫，胡国清.survivin蛋白在鼻咽癌组织中的表达及临床意义[J].中华耳鼻咽喉杂志，2004，39（12）：759760.

[8]糜福顺.细胞存活曲线［A］.见：谷铣之，殷蔚伯，刘泰福，等.肿瘤放射治疗学[M].北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1993.232237.

[9]Gunawardena K,Murray DK,Swope RE， et al.Inhibition of nuclear factor kappaB induces apoptosis following treatment with tumor necrosis factor alpha and an antioxidant in human prostate cancer cells[J].Cancer Detect Prev，2002，26(3):229237.

[10]Foo SY,Nolan GP.NFkappa B to the rescue: RELs,apoptosis and cellular transformation[J].Trends Genet，1999，15(6):229235.

[11]唐发清，唐敏，顾焕华，等.LMP1通过survivin抑制60Co诱导鼻咽癌细胞凋亡[J].中华放射肿瘤学杂志，2003，12（2）：120124.

[12] Suzuki A,Ito T,Kawano H,Hayashida M,et al.survivin initiates procaspase 3/p21 complex formation as a result of interaction with Cdk4 to resist Fasmediated cell death[J].Oncogene，2000，19(10):13461353.

[13]Asanuma K,Moriai R,Yajima T,et al.survivin as a radioresistance factor in pancreatic cancer [J].Jpn J Cancer Res,2000，91(11):12041209.

[14]Tang F,Tang T,Cao Y,et al.Epstein barr virus LMP1 triggers the expression of inhibitor of opoptosis protein surviving via NFκB and AP1 signaling pathways in nasopharyngeal carcinoma［J］.Expt Oncol,2003,25(1):2832.