冰茶栓含药血清诱导人胃癌SGC-7901细胞凋
发表时间：2009-08-04 浏览次数：520次
作者：何国浓 童晔玲 严继贵 俞丽霞 王泽时 作者单位：浙江中医药大学药理教研室，浙江 杭州 310053
【摘要】［目的］ 观察冰茶栓含药血清对体外培养的胃癌SGC-7901细胞凋亡的诱导作用。 ［方法］ 通过血清药理学的方法制备冰茶栓含药血清。将冰茶栓含药血清与体外培养的人胃癌SGC-7901细胞共同培养48h后，应用光学显微镜观察细胞形态的变化；用DNA琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段的梯状条带；用流式细胞术检测凋亡峰（亚G1峰）来分析研究冰茶栓含药血清诱导的细胞凋亡。 ［结果］ 经过冰茶栓含药血清作用后，SGC-7901细胞在显微镜下呈现典型的凋亡形态学改变；DNA琼脂糖凝胶电泳有特异性梯状条带出现；流式细胞仪检测出现凋亡峰，并显示凋亡率为27.44%，而空白血清组凋亡率仅为4.71%。［结论］ 冰茶栓含药血清可诱导胃癌细胞SGC-7901发生凋亡，为冰茶栓临床抗胃癌治疗提供实验依据。
【关键词】 冰茶栓 含药血清 胃肿瘤 细胞凋亡 血清药理学
复方中药冰茶栓是由浙江中医药大学王泽时教授和俞丽霞教授共同开发研制而成。它以蛇毒、茶叶以君臣配伍而成，有解毒止痛、宣通气机之功效。目前的临床研究中发现该药不但对癌痛有显著的镇痛作用，而且对肿瘤也有一定的作用，具有良好的开发价值[1，2]。本实验用冰茶栓含药血清对体外培养的胃癌细胞SGC-7901进行干预，观察它对胃癌细胞凋亡的诱导作用。
1 材料与方法
1.1 材 料
冰茶栓，由浙江中医药大学肿瘤研究室提供。RPMI-1640培养粉，购自美国Gibco公司。新生小牛血清，购自杭州四季青生物工程材料有限公司。
1.2 实验动物
Wistar大鼠，体重220g~250g，由浙江中医药大学实验动物中心提供。
1.3 含药血清的制备[3]
以Wistar大鼠16只，随机分成冰茶栓组和空白血清组，每组8只。冰茶栓组每日直肠给予冰茶栓，每日2次。给药剂量为临床人用剂量的8倍。按通法[4]，连续给药10d后，于末次给药1h后，乙醚麻醉，腹主动脉采血，无菌分离血清，56℃、30min灭活，置于-20℃冰箱保存备用。
1.4 人胃癌细胞培养
人胃癌SGC-7901细胞株，由浙江中医药大学生命科学学院分子与遗传教研室惠赠。将传代的人胃癌细胞SGC-7901接种于含100μg/ml青、链霉素和10%小牛血清的RPMI-1640培养液中（以下简称培养液），细胞浓度为1×105/ml，置于5% CO2、37℃培养箱中培养。培养至细胞生长旺盛后，弃去培养液，加入含15%含药血清的培养液5ml（另设一空白血清对照组），继续培养48h。
1.5 显微镜下细胞形态学观察
HE染色后观察细胞形态的变化。在灭过菌的24孔板中放入无菌玻片，将1×105/ml细胞加入24孔培养板中，每孔1ml。待细胞贴壁后，弃去原培养液，加入含15％含药血清的培养液继续培养48h后，取出玻片用95％酒精固定30min，PBS洗。苏木精染10min，自来水洗，稀盐酸—酒精分色，淡氨水蓝化后再自来水洗。接着伊红复染5min后自来水洗。最后分别用70％、80％、90％、100％的酒精脱色，二甲苯透明，中性树胶封片。置于光学显微镜下进行形态学观察。另设空白血清对照组。
1.6 DNA琼脂糖凝胶电泳检测梯状条带
培养48h后的SGC-7901细胞用1％胰酶消化，离心，1 500r/min×10min，PBS洗2次，收集1×108个细胞，按传统方法稍作改动提取DNA[5]，1.5%琼脂糖凝胶，80V恒压电泳，紫外灯下观察DNA条带，数码相机采集图像。另设空白血清对照组。
1.7 流式细胞仪检测凋亡细胞
将培养48h后的细胞用1％胰酶消化，离心，1 500r/min×8min，PBS洗2次，收集5×106个细胞，在震荡状态下缓慢滴入75％乙醇3ml左右，轻轻吹散细胞，固定过夜。用PBS洗，调至1ml，按试剂盒说明依次加入A液10min、B液10min、C液30min，上机检测。检测1万个以上的细胞。另设空白血清对照组。
2 结 果
2.1 人胃癌细胞形态学观察
活体生长形态的观察：经含药血清处理48h后，可见SGC-7901细胞数量减少，体积缩小，细胞变圆甚至脱落，细胞膜有皱缩，胞质内呈颗粒小块状，细胞折光性增强。空白血清培养的细胞已铺满细胞瓶底部，仍贴壁生长，有少数细胞脱落。
HE染色后细胞形态学的观察：含药血清作用48h后的SGC-7901细胞核固缩、边缘化，核膜裂解，染色质分割成块状。空白血清培养的细胞核完整，无明显变化。
2．2 琼脂糖凝胶电泳结果
含药血清培养48h后的SGC-7901细胞可见到典型的梯状电泳条带，即DNA Ladder。如图1所示。
2．3 流式细胞仪检测凋亡细胞
含药血清处理48h后的SGC-7901细胞在DNA直方图上出现明显的细胞凋亡峰，凋亡率达到27.44%。而空白血清处理48h后的SGC-7901细胞在DNA直方图上未出现明显的细胞凋亡峰，凋亡率也仅为4.71%。
3 讨 论
近年来开展的血清药理学是一种新的体外实验方法，这就避免了在体外实验中药物直接与细胞作用的各种干扰因素，接近药物在体内环境中产生药理效应的真实过程，使实验结果更具科学性和真实性[6]。本实验通过血清药理学的实验方法成功制备了冰茶栓含药血清，并诱导了人胃癌细胞SGC-7901凋亡。
本实验证明，经冰茶栓含药血清作用48h后的细胞不仅数量减少，在细胞形态方面也发生明显改变，如细胞体积缩小，细胞变圆甚至脱落，细胞膜有皱缩，胞质内呈颗粒小块状，细胞折光性增强等；经HE染色后看到细胞核固缩、边缘化，核膜裂解，染色质分割成块状；经DNA琼脂糖凝胶电泳后也发现了DNA特征性的梯状条带；经流式细胞仪检测后，DNA直方图上出现明显的细胞凋亡峰，且凋亡率达到27.44%。以上结果均呈现了细胞凋亡的特征，而经空白血清作用后的细胞无上述特征的改变，这表明冰茶栓确实具有诱导人胃癌细胞SGC-7901凋亡的能力。且从DNA直方图我们还可以看出，冰茶栓含药血清是通过把细胞阻滞于G1期而抑制细胞增殖，从而达到诱导细胞凋亡的作用。这可能是冰茶栓治疗胃癌的机制之一。
【参考文献】[1] 孙在典, 王泽时. 中药蛇毒结合小剂量锝99m治疗癌痛的初步探讨[J].中华实用中西医杂志,1995,8(2):107-108.
[2] 王泽时, 俞丽霞, 张信岳， 等. 神农戒毒栓对海洛因成瘾猴戒毒机理的初步报道[J]. 浙江中医学院学报，1997, 21(1):42.
[3] 李仪奎. 中药血清药理学实验方法的若干问题[J]. 中药新药与临床药理, 1999, 10(2):95-96.
[4] 李仪奎, 吴健宇. 血清药理实验中采血时间的通法方案[J]. 中国药理学通报, 1999, 15(6):569-570.
[5] 夏飞, 刘胜武, 魏雅稚, 等. 在细胞凋亡检测中DNA提取方法的优化[J]. 武汉大学研究生学报（医学版），2004，20（2）：40-43.
[6] 薛洁, 谢梅林. 中药血清药理学的方法学研究近况[J]. 中草药, 2003, 34（6）：附9-11.
