低分子量姬松茸多糖对小鼠S180肉瘤的抑制作用及其机制

　　作者：牛英才 赵学梅 张春 周丽 刘吉成    作者单位：161042 黑龙江齐齐哈尔医学院医药科学研究所

　　【摘要】  目的 观察LMPAB对小鼠S180肉瘤生长的抑制及诱导凋亡的作用。方法 BALB/c小鼠右后侧腋窝皮下接种S180瘤株后，腹腔分别注射50、100和200mg/(kg·d) LMPAB，连续7d，给药结束后24h处死小鼠，称肿瘤重量。Annexin Ⅴ²FITC/PI双染法（流式细胞仪）检测肿瘤组织细胞凋亡。结果 与模型组（1.038±0.262）比较，猪苓多糖组（0.704±0.262）和LMPAB高剂量组（0.695±0.096）肿瘤重量明显减轻（P＜0.01）。猪苓多糖组、姬松茸粗多糖组、LMPAB低剂量组、LMPAB中剂量组和LMPAB高剂量组对S180肉瘤的平均抑制率分别为32%、23%、9.5%、23%和32%。与模型对照组比较，猪苓多糖组、姬松茸粗多糖组、LMPAB低剂量组、LMPAB中剂量组和LMPAB高剂量组的肿瘤细胞凋亡率明显增加，差异具有统计学意义（P＜0.01）。结论 LMPAB对S180肉瘤生长具有抑制作用，其机制可能是通过促进肿瘤细胞凋亡而实现的。

　　【关键词】  姬松茸 多糖 细胞凋亡 抗肿瘤

0  引言   　　自20世纪50年代末人们发现真菌多糖具有抗肿瘤活性以来，多糖的研究受到越来越广泛的关注。多糖是由单糖连接而成的生物大分子物质，多糖的糖链能控制细胞的增殖和分化，调节细胞的生长与衰老，在抗肿瘤和促进免疫力方面疗效明确，毒副作用小[1²2]。姬松茸（agaricus blazei murill, ABM）是一种药食兼用的真菌，在日本被作为恶性肿瘤化疗药物的辅助治疗品种[2]。药理学研究表明，姬松茸多糖是姬松茸抗肿瘤的活性成分［3］。姬松茸粗多糖中有大量的植物蛋白，使多糖纯度降低并存在诱发机体过敏反应的潜在危险。与姬松茸大分子量多糖相比较，低分子量的多糖具有溶解性好、黏度低和易吸收等特点。本研究以荷S180肉瘤小鼠为模型，通过称重法检测肿瘤重量和Annexin V²FITC双染色法流式细胞仪检测肿瘤细胞凋亡，探讨低分子量姬松茸多糖（low molecular weight polysaccharide isolated from Agaricus blazei Murill，LMPAB）对小鼠S180肉瘤的抑制作用及其机制。

　　1  材料与方法

　　1.1  实验材料

　　1.1.1  药物  LMPAB由齐齐哈尔医学院医药科学研究所分离提取[4]，猪苓多糖注射液购自江苏省正大天晴药业股份有限公司，姬松茸粗多糖购自浙江庆元博瑞药业有限公司。

　　1.1.2  实验动物及瘤株  BALB/c雄性小鼠，SPF级，6周龄，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证编号：SCXK（京）2002²0003，隔离器内分笼饲养。S180腹水型瘤株购于黑龙江省肿瘤医院肿瘤研究所，由昆明小鼠腹水传代。

　　1.1.3  仪器和试剂   　　FACS Calibur流式细胞仪（美国BD公司），AE²240型电子天平（梅特勒²托利多仪器有限公司），Annexin V²FITC凋亡检测试剂盒（北京宝赛生物技术有限公司）。

　　1.2  方法

　　1.2.1  分组处理  72只小鼠随机分为模型组、LMPAB低剂量组、LMPAB中剂量组、LMPAB高剂量组、姬松茸粗多糖对照组和猪苓多糖对照组，共6组，每组12只。

　　1.2.2  造模及给药  取荷腹水型S180瘤株小鼠的腹水0.2ml， 接种于昆明小鼠腹腔，7d后，处死精神状态良好和腹水饱满的荷瘤小鼠，消毒腹部，于超净工作台中抽取乳白色腹水为瘤源，生理盐水洗涤，离心，稀释成单细胞悬液。台盼蓝染色检测细胞数，活细胞数为98%以上可接种。调整细胞浓度为1×107 /ml，每只小鼠于右后侧腋窝皮下接种0.2ml，整个操作过程在30min内完成。小鼠接种S180肉瘤后第2天，LMPAB低剂量组、LMPAB中剂量组和LMPAB高剂量组分别按50mg/(kg·d)、100 mg/(kg·d)和200mg/(kg·d)腹腔注射给药，姬松茸粗多糖组和猪苓多糖对照组按1000mg/(kg·d)和5mg/(kg·d)腹腔注射给药，模型对照组腹腔注射等体积的生理盐水，共7d。

　　1.2.3  抑瘤率测定  小鼠颈椎脱臼处死，在冰台上用镊子镊住小鼠右肋肿瘤生长部位皮肤，手术剪子剪开皮肤，暴露肿瘤并用手术镊钝性剥离，电子天平称量肿瘤重量。按下列公式计算肿瘤抑制率：肿瘤抑制率（%）=[1-（平均实验组肿瘤重量/平均对照组肿瘤重量）]×100%

　　1.2.4  LMPAB对荷瘤小鼠肿瘤细胞凋亡的影响  (1) 细胞悬液制备  取新鲜肿瘤组织（尽量除去血管及凝血块），加入新鲜配置的无菌PBS（2ml，4℃），采用剪切法分散肿瘤组织，经100目滤网过滤后，1500r/min 4℃离心8min，弃上清；再加入2ml PBS，轻微振荡，1000r/min 4℃离心5min，弃上清；再加入1ml PBS制成单细胞悬液，70%冷乙醇固定。 (2)Annexin V荧光染料检测细胞凋亡  调整待测肿瘤细胞的浓度为1×106 / ml，取1ml PBS洗3遍，4℃ 1000r/min离心10min，弃上清。加入预冷的结合缓冲液重悬细胞，加入10μl Annexin V²FITC和5μl PI，轻轻混匀，4℃反应30min。加入300μl预冷的结合缓冲液重悬细胞，流式细胞仪检测。

　　1.3  统计学方法   　　计量资料用±s表示，用SPSS13.0统计软件进行分析。多组间差异的显著性分析用单因素方差分析（one²way ANOVA），组间两两比较方差齐用SNK检验，方差不齐用Tamhane检验。

　　2  结果

　　2.1  LMPAB对荷瘤小鼠肿瘤重量的影响   　　与模型组相比较，猪苓多糖组（0.704±0.096）和200mg/kg剂量的LMPAB组（0.695±0.096）肿瘤重量明显减少（P＜0.05）；而100mg/kg剂量LMPAB组（0.790±0.158）、50mg/kg剂量LMPAB组（0.937±0.137）和姬松茸粗多糖组（0.796±0.141）的肿瘤重量与模型组比较差异均无统计学意义（P>0.05），见图1。

　　*：与模型组比较，P＜0.05；#：与猪苓多糖组比较，P＜0.01

　　图1  LMPAB对荷瘤小鼠肿瘤重量的影响（略）

　　Fig 1  Effect of LMPAB on the S180 xenograft growth in mice

　　2.2  LMPAB对荷瘤小鼠肿瘤细胞凋亡的影响   　　与模型对照组比较（10.98±1.55），猪苓多糖对照组（22.36±4.34）、姬松茸粗多糖对照组（31.69±2.94）、LMPAB低剂量组（18.71±2.52）、LMPAB中剂量组（32.17±5.1）和LMPAB高剂量组（39.21±3.85）的凋亡率明显增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与猪苓多糖对照组比较，姬松茸粗多糖对照组、LMPAB中剂量组和LMPAB高剂量组瘤细胞凋亡率增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）,见图2。

　　*：与模型组比较，P＜0.05；#：与猪苓多糖组比较，P＜0.01

　　图2  LMPAB对荷瘤小鼠肿瘤细胞凋亡的影响（略）

　　Fig 2  Effect of LMPAB on the apoptosis of S180 xenograft in mice

　　3  讨论   　　恶性肿瘤的基本生物学特征是细胞增殖失控、分化受阻与凋亡障碍。传统的放化疗主要是抑制肿瘤细胞的增殖，特异性较差，副作用较多，在机体可能承受的条件下难以从根本上清除肿瘤细胞。随着肿瘤学的发展，人们对肿瘤治疗的认识逐渐由非特异性“毒性杀伤”深入到特异性的“靶向治疗”，即诱导肿瘤细胞凋亡[5]。细胞凋亡是由于内外环境变化或死亡信号触发，在相关基因调控下引起的细胞主动死亡过程，在生理状态下能消除机体内老化细胞及潜在性异常生长细胞，对于保持机体稳态发挥重要作用。凋亡调控可引起人体多种疾病，也是肿瘤发生的重要原因，近年来研究发现植物多糖能诱导肿瘤细胞凋亡是其抗肿瘤作用机制之一[6²7]。因此，寻找有效的肿瘤细胞凋亡诱导多糖，对于进一步改善肿瘤患者预后、延缓生存甚至治疗具有重要意义。   　　细胞发生早期凋亡时，原先位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine, PS）翻转至膜外侧，在钙离子存在的情况下，与Annexin V²异硫氰酸荧光素（FITC）结合而显色，被流式细胞仪检测为阳性细胞。利用凋亡细胞膜结构仍较完整的特点，此时在反应体系中再加入碘化丙啶（PI）即可将凋亡细胞和死亡细胞加以区别[8]。利用Annexin V和PS的高度亲和作用可以早期检测细胞凋亡的发生，具有较高的时效性。   　　姬松茸又名小松菇、柏氏蘑菇和巴西蘑菇，1965年，日裔巴西人将这种美味食用菌引入日本并取名为姬松茸，1992年，我国福建省农科院引进了该菌种。众多研究表明，姬松茸子实体、菌丝体、提取物和发酵液都具有一定的抗癌功效[9]。我们将姬松茸子实体经水提、醇沉、脱蛋白和层析纯化得分子量为48 000的多糖，并命名为LMPAB。经结构分析发现其主体结构为β²(1→3)²D葡聚糖，对其生物活性的研究表明10μg /ml该多糖对K562细胞有直接细胞毒作用。   　　本实验结果表明，LMPAB具有抑制肉瘤S180生长的作用。姬松茸粗多糖对照组、LMPAB低剂量组、LMPAB中剂量组和LMPAB高剂量组对S180的平均抑制率分别为23%、9.5%、23%和32%，其中LMPAB高剂量组抑瘤率大于30%，符合抗癌药物筛选标准。与模型对照组比较，姬松茸粗多糖对照组、LMPAB低剂量组、LMPAB中剂量组和LMPAB高剂量组的肿瘤细胞凋亡率明显增加，差异具有统计学意义（P＜0.01），表明LMPAB具有诱导细胞凋亡作用，并呈量效依赖关系。

【参考文献】     ［1］ 白雪，林晨，江振友，等. 硒化麒麟菜多糖抑制人喉癌细胞株Hep²2增殖的作用[J]. 肿瘤防治研究，2007，34（4）：249²252.

　　[2] 郭峰，张乐之，王海滨.红细胞在免疫治疗中的重要应用价值［J］.中国肿瘤生物治疗杂志，2000，7（2）：81²82.

　　[3] Firenzuoli F, Gori L, Lombardo G. The Medicinal Mushroom Agaricus blazei Murrill: Review of Literature and Pharmaco²Toxicological Problems[J].Evid Based Complement Alternat Med, 2008, 5 (1): 3²15.

　　[4] 刘吉成，孙建宁. 低分子量姬松茸多糖提取分离及抗肿瘤活性筛选研究[J]. 中华中医药杂志， 2006，21（5）：190²193.

　　[5] van Ginkel PR, Sareen D, Subramanian L, et al. Resveratrol inhibits tumor growth of human neuroblastoma and mediates apoptosis by directly targeting mitochondria[J]. Clin Cancer Res, 2007, 13 (17): 5162²5169.

　　[6] 江曼. 细胞凋亡及其与肿瘤治疗[J]. 肿瘤防治研究, 2001, 28（6）：490²498.

　　[7] Lai ZC, Wei X, Shimizu T, et al. Control of cell proliferation and apoptosis by mob as tumor suppressor, mats[J]. Cell, 2005, 120 (5): 675²685.

　　[8] Brumatti G, Sheridan C, Martin SJ. Expression and purification of recombinant annexin V for the detection of membrane alterations on apoptotic cells[J]. Methods, 2008, 44 (3): 235²240.

　　[9] Akiyama H, Kondo K. Agaritine and phenylhydrazine derivatives in Agaricus bisporus and Agaricus blazei Murrill[J]. Shokuhin Eiseigaku Zasshi, 2007, 48 (6): 397²401.