NET21、Ki67和CD34在胃癌组织中的表达及其临床病理意义

作者：王桂 陈莉 李杏玉 王酉 钱铮    作者单位：226001江苏南通大学医学院病理教研室;海门市第一人民医院病理科

【摘要】  目的 探讨胃癌组织中NET²1、Ki67和CD34表达的临床病理学意义。方法 应用免疫组化二步法检测86例胃癌组织中NET²1、Ki67和CD34的表达，对三指标均阳性病例进行免疫组化三重标记法双染方法，原位检测三指标的表达特点和毗邻关系。所有病例随访60月以上。结果 胃癌组织中 NET²1、Ki67和CD34高表达分别为56.98%、74.42%和62.79%，三指标阳性表达呈显著正相关（P<0.01）。三指标高表达分别与肿瘤临床分期呈正相关（均P<0.05），与患者生存率呈负相关（均P<0.05）， 其3、5年生存率均显著低于相应的低表达组或阴性组（P<0.05，P<0.01）。 NET²1、Ki67高表达分别与肿瘤分化呈负相关（均P<0.01）。NET²1、CD34高表达分别与癌浸润深度、淋巴结转移呈正相关（均P<0.05）。结论 NET²1、Ki67和CD34在胃癌组织中高表达与癌细胞增殖、癌血管形成和预后差有关。

【关键词】  胃癌 NET²1 Ki67 CD34 临床病理因素 预后

0  引言   　　胃癌是目前世界上第二常见的癌症[1]，60%发生在发展中国家[2]，在日本其发病率显著高于西方国家达20倍，可能与环境因素或与遗传易感性有关[3]。NET²1是新近发现的一个肿瘤增殖相关蛋白，属于四聚体超家族成员[4]，在细胞信号转导、调节、粘附、移动、增生和分化中起重要作用，已见存在于宫颈癌、肝癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌等[4²6]。Li Chen等[4]研究结果显示肝癌组织NET²1基因过表达可以促进肝癌细胞失控性增生与失分化；Volker等[6]发现该基因表达水平与宫颈癌组织恶性程度呈正相关，与癌组织分化程度呈负相关，结合随访结果显示还可能是宫颈癌预后的指标。但胃癌中NET²1表达意义的研究目前在国内外文献中均未见报道。   　　Ki67作为一个重要的细胞增殖标记[7]，已报道[8]在胃癌中有高表达，并与癌的生物学行为和预后密切相关。CD34作为跨膜单链糖蛋白分子量为105kd～120kd，定位于1号染色体长臂，主要表达在造血前体细胞和血管内皮细胞上，又称为人原始造血细胞抗原(Human hepatopoietic proenitor cell antigen)，与血管生成密切相关，是内皮细胞特异的标记物[9]。肿瘤血管生成已成为判断恶性肿瘤转移及预后的重要指标。   　　本文研究86例胃癌组织中NET²1、Ki67和CD34抗原表达与其临床病理因素及患者预后之间的关系。应用免疫组织化学二步法与免疫组化三重标记双染法，在同一张组织切片原位显示三种抗原的分布特点和毗邻关系，客观的分析胃癌细胞核、细胞质及其间质中三种抗原表达意义，进一步理解和阐明NET²1作为肿瘤相关蛋白的分子机制。

　　1  资料与方法   　　取1994年12月～1996年12月间在南通地区海门市人民医院住院治疗的胃癌86例，男57例，女29例，平均年龄57.6岁（32～79岁）。术前全部病例均未行放、化疗。平均随访72月（60～90月）。将本组胃癌按部位分为胃窦部、贲门部、小弯部、其他部位；肿瘤平均大小为7.6cm（2.8～16.5cm）。将浸润深度分为浸润到浅肌层（<1/2）、深肌层（>1/2）、浆膜层内或外。胃癌组织学类型根据WHO分类[10²11]分为乳头状腺癌、管状腺癌、黏液腺癌、印戒细胞癌和其他，包括小细胞癌、未分化癌等；根据癌细胞分化为高、中、低进行病理分级（1～3级）[12]，根据淋巴结的检查结果判断肿瘤转移；根据AJCC的TNM进行胃癌的临床分期[11]为Ⅰ～Ⅳ期。

　　1.1  免疫组化二步法(Envision) 检测NET²1、Ki67和CD34的表达   　　参照试剂说明书分别检测NET²1、Ki67和CD34表达，石蜡切片脱蜡至水，微波抗原修复，二步法过氧化物酶阻断液(Dakocytomation, Glostrup, Denmark)孵育5 min，第一抗体NET²1，工作浓度1/200（由作者设计，美国ZYMED公司协助合成[7]）；鼠抗人单克隆抗体ki67（Lot:41081001）购于美国ZYMED公司（由北京中杉金桥生物技术有限公司代理）工作浓度1/100；鼠抗人原始造血细胞单克隆抗体CD34（Lot:50405117）购于美国ZYMED公司（由北京中杉金桥生物技术有限公司代理）工作浓度1/100，室温30 min，二步法/HRP处理，DAB染色。苏木素轻微衬染。

　　1.2  免疫组化三重标记双染法组织原位检测NET²1、Ki67和CD34的共表达   　　取NET²1、Ki67和CD34均阳性的病例进行免疫组化三重标记双染法同时检测三种标记在胃癌组织中原位表达与分布。具体步骤参照试剂说明书进行：石蜡切片脱蜡至水；高温抗原修复，二步法过氧化物酶阻断液孵育5min，孵育一重标记一抗Ki²67，37℃ 60min，加羊抗鼠抗体与碱磷酶系统处理37℃ 30min，BCIP/NBT（Histostaink²Dskit CAT.NO:95²9999）显色液显色。重复阻断反应，加二重标记一抗NET²1, 37℃孵育60min，4℃过夜，羊抗兔抗体与辣根过氧化物酶系统处理37℃ 30min，DAB染色。重复阻断反应，加第三重标记一抗CD34 ，37℃ 60min，4℃过夜，羊抗鼠抗体与辣根过氧化物酶系统处理37℃ 30min，AEC（Histostaink²Dskit CAT.NO:95²9999）显色液显色。其余步骤同免疫组化二步法。   　　每组实验均设阳性对照组（取肝癌细胞NET²1过表达，增生淋巴结生发中心细胞Ki67高表达，乳腺癌间质微血管内皮细胞CD34高表达作为阳性对照组），用PBS液代替第一抗体作为阴性对照。另取10例胃溃疡手术标本切缘组织，作为非肿瘤对照组。

　　1.3  免疫组化结果判断标准

　　1.3.1  在200倍视野下综合观察NET²1和Ki67的表达强度与分布范围进行半定量判断。根据肿瘤组织中阳性细胞占的百分比，取其均值，无阳性反应为阴性，NET²1阳性表达于癌细胞的胞质或胞膜，其中<50%为低表达，≥50%为高表达；Ki67阳性表达于癌细胞核，<10%为低表达，≥10%为高表达。

　　1.3.2  CD34表达于血管内皮细胞，当CD34表达的内皮细胞簇形成管腔或血管塑型时，均作为一个单一的微血管计数。对管腔面积>8个红细胞直径，或有较厚肌层的血管，或单个阳性细胞均不计数。确定肿瘤浸润前缘3个高血管密集区（热点区），然后在高倍视野(High Powerview HPV)（×200）内用计算机图象分析系统（江苏捷达科技公司）计数微血管密度（Microvessel density，MVD），取其均值作为该例MVD值。MVD值<15/HPV为CD34低表达；≥15/HPV为CD34高表达。

　　1.3.3  免疫组化三重标记双染法结果判断   　　NET²1表达于胃癌细胞质或膜呈褐色（DAB）。Ki²67表达于细胞核呈蓝黑色（BCIP/NBT）。CD34表达于癌间质血管内皮细胞呈桃红色（AEC）。

　　1.4  统计学方法    　　用Stata9.0软件处理。NET²1、Ki67与CD34三指标表达的相关性分析用Spearman等级相关分析；根据不同临床病理因素表达阳性率之间比较用Fisher直接计算概率法，等级分组变量间表达阳性率的趋势分析用χ2检验；生存曲线用Kaplan²Meier估计，两组曲线的比较用Log²rank（时序）检验。检验意义水准为P<0.05。

　　2  结果　　　　2.1  胃癌组织中NET²1、Ki67和CD34的表达特征   　　NET²1表达在癌细胞膜上或胞质中，见图1、2。Ki67阳性定位于胃癌细胞核中，见图3。CD34显示癌间质的微血管，见图4。胃癌中MVD均值为27.8+/-10.3（4-52）。实验选用的阳性对照组均显示为阳性表达。阴性对照均未检出NET²1、Ki67和CD34的阳性表达。10例非肿瘤胃黏膜中NET²1均匀分布于胞浆，均呈低表达，MVD值9.64+/-3.50（3-29），3例偶见基底层细胞Ki67核表达。    　　对46例三指标均为过表达的病例进行免疫组化三重标记双染，在同一张切片上三种标记通过不同的显色剂分别表达了组织的不同部位，NET²1阳性表达在癌细胞胞质或胞膜呈褐色，Ki67表达在癌细胞核呈蓝黑色，癌间质CD34阳性血管呈桔红色，见图5、6。免疫组化三重标记双染在组织原位显示三指标表达呈正相关。

　　2.2  胃癌NET²1、Ki67和CD34表达的相关性   　　结果见表1。

　　表1  胃癌NET²1、Ki67、CD34表达的相关性（86例）（略）

　　Tab 1  The expressions relationship of NET²1、Ki67、CD34  in gastric carcinoma

　　*Including 8 case negative; **Spearman grade correlation analysis

　　图1  低分化胃癌,癌细胞胞浆或胞膜NET²1高表达（免疫组化二步法×200） （略）

　　图2  高分化胃癌,癌细胞胞膜NET²1高表达（免疫组化二步法×200）（略）    　　　　图3  中分化胃癌，ki67高表达（免疫组化二步法×200）（略）  

　　图4  中分化胃癌CD34高表达（免疫组化二步法×200）（略）

　　图5  高分化胃癌癌NET²1定位于腺腔缘褐色，Ki67定位于细胞核蓝黑色，CD34定位于癌间质血管红色（免疫组化三重标记双染法×400）（略）

　　图6  低分化胃癌NET²1定位于癌细胞浆褐色，Ki67定位于细胞核蓝黑色、CD34定位于癌间质血管红色（免疫组化三重标记双染法×200）（略）

　　Fig 1  Positive expression of NET²1（+++）  in cytoplasm of poorly differentiated gastric carcinoma（Immunohistochemical S²P method×200）

　　Fig 2  Positive expression of NET²1（+++）   in cell membrane of well differentiated gastric carcinoma（Immunohistochemical S²P method×200）

　　Fig 3  Positive expression of ki67 （++）in moderately differentiated gastric carcinoma（Immunohistochemical S²P method×200）

　　Fig 4  Moderately differentiated gastric carcinoma serum CD34 positive MVD>10/HPV（Immunohistochemical S²P method×200）  　　Fig 5  Positive expression of NET²1（+）brown²yellow,Ki67（+）Blue²black,CD34 （+）red at the edge of glandular cavity in well differentiated gastric carcimoma（Immunohistochemical Di²S²P trimarkers method×200）

　　Fig 6  Poorly differentiated gastric carcinoma cytoplasm NET²1（+++）brown²yellow Ki67 （+++） blue²black CD34 （++）red ( Immunohistochemical Di²S²P trimarkers method×200）    　　对表1结果进行组间相关性分析，显示NET²1和Ki67的表达、NET²1和CD34表达、Ki67和CD34表达均呈正相关（P<0.01）。

　　2.3  胃癌NET²1、Ki67、CD34表达与其临床病理因素的关系   　　结果显示：NET²1表达与癌分化、转移及临床分期密切相关（P<0.01或 P<0.05）,中、低分化组间差异有统计学意义（χ2=6.3708,  P<0.01）。Ki67表达与癌分化、临床分期密切相关（P<0.01和P<0.05）,中、低分化组间差异有统计学意义（χ2=5.7509,P<0.05）。CD34表达与癌浸润、转移、临床分期呈显著相关（P<0.01或P<0.05）。癌浸润胃壁超过1/2时CD34过表达显著高于癌浸润胃壁不到1/2组（χ2=44.2392,P<0.01）。在胃癌不同发生部位、不同组织学类型的各组中NET²1、Ki67、CD34表达差异无统计学意义（均P>0.05）。　　　　2.4  胃癌NET²1、 Ki67、CD34表达与患者预后的关系   　　NET²1高表达组患者3、5年生存率均显著低于低表达组（P<0.05和P<0.01）。Ki67高表达组患者3、5年生存率显著低于低表达组或阴性组（P<0.05和P<0.01）。CD34高表达组患者5年生存率显著低于低表达组（P <0.05），但3年生存率的差异在两组间差异无统计学意义（P>0.05）。   　　Kaplan²Meier生存曲线比较显示： NET²1高表达组生存率显著低于低表达组（时序检验：χ2=4.55,P<0.05）。Ki67高表达组生存率显著低于Ki67低表达或阴性组（时序检验：χ2=5.79,P<0.05）。CD34高表达组生存率显著低于低表达组（时序检验：χ2=4.13,P<0.05），见图7～9。

　　3  讨论   　　本文通过在胃癌中检测NET²1表达，研究其与癌生物学行为和临床病理因素的关系。结果发现NET²1定位于胃癌细胞质或胞膜，在本组胃癌中56.98％过表达，显著高于非肿瘤性胃黏膜，其表达与癌病理分级、临床分期、转移、预后密切相关，并呈显著正相关趋势，癌中NET²1表达越强，癌细胞分化程度越低、肿瘤越易转移，其临床分期越高。生存曲线比较显示NET²1高表达的患者术后3、5年生存率分别为44.90%和22.53%均显著低于相应低表达组67.57%和57.76%。该结果与Volker等[6]在宫颈癌中研究的结果类似，并报道NET²1的表达水平与宫颈癌组织恶性程度呈正相关，与癌组织分化程度呈负相关，说明了该基因在判断肿瘤细胞增殖能力和预后方面的价值。结果提示NET²1的表达可能与胃癌发生发展过程密切相关，但其中的精确分子机制尚未完全阐明。但NET²1基因在人体大部分正常组织和肿瘤组织中均有表达，特别是在多种肿瘤中高表达，说明NET²1基因是一个广谱癌相关基因。    　　Ki67抗原是1984年由Gerdes等［13］发现在增殖细胞中表达的一种核抗原，也是目前较为肯定的核增殖标志基因，存在于细胞周期中除G0期以外的所有阶段。它开始表达于细胞周期的G1期，在S期及G2期表达增加，至M期达高峰，在分裂晚期很快消失。由于其半衰期短，脱离细胞周期后迅速降解，故已成为目前检测肿瘤细胞增殖活性最可靠的指标[13]。文献报道在胃癌组织Ki67阳性率为4.6%～82% (mean, 22%)[7²8]。本研究检测86例胃癌组织中Ki67高表达率为74.42%，与文献报道基本相符。胃癌组织中Ki67表达与胃癌分化程度和临床分期密切相关；临床分期Ⅲ～Ⅳ期中Ki67高表达显著高于Ⅰ～Ⅱ期。生存曲线比较显示Ki67高表达的患者术后3、5年生存率45.31%和35.91%均显著低于相应低表达或阴性组77.27%和72.73%。该结果证实了Ki67基因表达与胃癌的增殖及预后密切相关。Ki67在非肿瘤性胃黏膜中不表达，说明该组织增生活性较低。

　　图7  NET²1高表达组和低表达组的生存曲线比较（略）

　　图8  Ki67高表达组和低表达组/阴性组生存曲线比较（略）

　　图9  CD34高表达组和低表达组生存曲线比较（略）

　　Fig 7  Comparison survival curve between  NET²1 strong positive group and NET²1 weakly positive group

　　Fig 8  Comparison survival curves between Ki67 positive group and Ki67 negative group

　　Fig 9  Comparison survival curve between MVD>15/HPV group and MVD≤15/HPV group    　　近年来对肿瘤血管生成的研究表明，血管生成在实体肿瘤的恶变、生长、转移等方面起至关重要的作用[9,14]。本研究取MVD值≥15/HPV为CD34过表达，胃癌中CD34高表达为62.79％，其与癌临床分期、浸润程度、转移密切相关，并呈显著正相关趋势。生存曲线比较显示CD34高表达的患者术后5年生存率31.48%显著低于相应低表达组56.25%。提示CD34抗原不仅能客观的反映肿瘤中MVD，并能作为判断胃癌转移及预后的重要依据。    　　本研究结果在同一张切片上肿瘤细胞质与膜NET²1表达时，常伴癌细胞核Ki67和间质微血管CD34表达，分析显示胃癌中NET²1、Ki67和CD34表达呈显著正相关，更客观地表明NET²1基因表达不但与癌细胞增殖有关，并且能显著促进肿瘤血管的形成，提示在胃癌进展中三个指标的协同作用。

【参考文献】  　　［1］ Pisani P,Parkin DM, Bray F, et al Estimates of the worldwide mortality from 25 cancers in 1990[J].Int J cancer,1999,83（1）:18²29.

　　[2] Hamilton SR,Aaltonen LA.Pathology and Genetics,Tumours of the Digestive System.WHO2000.

　　[3] Milae ANA, Carvalho R, Morsink FM,et al. Early onset gastric cancers have a different molecular expression profile than conventional gastric cancers[J]. Modern Pathology, 2006,19（4）:564²572.

　　[4] Li Chen,Dechuen Li York Zhu.The Expression of NET²1 Gene in Human Tissues, Chinese Medical Journal http://www.cmj.org.2002:8,/ U.S.Chinese International Journal of Bethune,2004,2(6):16²20.

　　[5] Xu J,Stolk JA,Zhang X, et al.Identification of differentially expressed genes in human prostate cancer using subtraction and microarray[J].Cancer Res,2000,60(6):1677²1682.

　　[6] Volker W,Rosemarie KH,Ines S,et al. Identification of a new proliferation associated protein NET²1/C4.8 characteristic for a subset of high²grade cervical intraepithelial neoplasia and cervical carcinomas[J]. Int J Cancer, 2002, 99(5) :771²775.

　　[7] Yomemura Y, Oeyarna S, Sugiyama K, et al. Growth fraction in gastric carcinoma detemined with monoclonal antibody Ki67 [J]. Cancer,1990,65（5）:1130²1134.

　　[8] M DeSilvio, L Khor, R Li, et al. Ki²67 Staining Is a Strong Predictor of Patient Outcome for Prostate Cancer Patients Treated with Androgen Deprivation Plus Radiotherapy Int J Radiat[J]. Oncol Biol Phys, 2003,57 (2):200²201.

　　[9] XU Qing²Bo.Endothelial progenitor cells in angiogenesis[J] .Acta Physiologica Sinica,2005,57 (1): 1²6.

　　[10] Arslan PC,Rugge M.Gastric cancer:problems in histological diagnosis[J].Histopathology,1982,6(4):391²398.　　　　[11] Irvin DF, Jay SC, Donald EH,et al. AJCC Cancer Sraging Manual.Fifth edition[M].Lippincott:Philadelpha. 1997.73.

　　[12] Anon.UICC:TNM classification of Pancreatic Carcinoma.Kanehara & Co.,Ltd.:Tokyo. 1997.

　　[13] Gerdes J，Lemke H，Baxsch H，et a1．Cell cycle analysis of a cell proliferation²associated human nuclear antigen defined by the monoclonal antibody Ki67[J].J Immunol，1984，133(4)：1710²1715.

　　[14] Ferraer N, Gerber HP,Lecouter J. The biology of VEGF and its receptors[J] . Nat Med, 2003,9(6):669²676.