chk2反义寡核苷酸对顺铂诱导卵巢癌SKOV3细胞凋亡的影响

作者:朱克修,李玢,王佳,韩晓兵

   【摘要】  目的：观察卵巢癌SKOV3细胞转染chk2反义寡核苷酸后在顺铂作用下细胞凋亡的变化. 方法：用MTT法检测不同浓度顺铂对SKOV3细胞的抑制率，Western Blot法检测SKOV3细胞中Chk2蛋白的表达. 流式细胞仪及TUNEL法检测转染chk2反义寡核苷酸后顺铂作用下SKOV3细胞凋亡情况. 结果：顺铂对SKOV3细胞的生长抑制率随浓度增高和时间延长而升高. Western Blot法检测证实转染chk2反义寡核苷酸后SKOV3细胞中Chk2蛋白表达受到明显抑制. 流式细胞仪检测抑制chk2基因表达后SKOV3细胞凋亡率为（77.6±1.7）%，明显高于正常组（24.7±1.76）%，空脂质体组（35.6±1.4）%及转染正义寡核苷酸细胞组（47.6±1.2）%. TUNEL法检测结果与流式细胞法一致. 结论：chk2可作为卵巢癌增敏治疗的有效靶点.

【关键词】  chk2基因；反义核酸技术；卵巢肿瘤；顺铂

       0引言

    肿瘤细胞的多耐药性已成为恶性肿瘤化疗失败的重要原因［1］，进行化疗增敏或寻找新的治疗手段具有重要意义. 细胞周期检测点是增强肿瘤治疗敏感性研究的热点之一［2］. 肿瘤的耐药与肿瘤细胞逃避放化疗诱导的肿瘤细胞凋亡有关，因为放化疗作用下可使细胞周期检测点激活，导致细胞周期停滞和细胞的损伤修复，从而使肿瘤细胞避免凋亡. 周期检测点激酶1，2 （check point kinase 1，2，Chk1，Chk2）是细胞周期检测点中最关键的效应蛋白酶［3］. 国外一些研究表明，转染chk1/chk2反义寡核苷酸可明显提高一些肿瘤模型对抗肿瘤药物的敏感性，说明chk1/chk2可能是一些肿瘤增敏治疗的有效靶点［4］. 本研究通过检测chk2反义寡核苷酸对顺铂诱导的SKOV3细胞凋亡的影响，以探讨chk2能否作为卵巢癌增敏治疗的有效靶点.

    1材料和方法

    1.1材料SKOV3细胞株由西安交通大学临床医学研究分子中心提供. RPMI 1640购自Gibco公司，胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司，噻唑蓝（MTT）购自Amressco公司，转染试剂Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司，鼠抗人Chk2 mAb购自NEOMARKERS公司，辣根酶标记羊抗鼠二抗购自博士德公司，原位细胞凋亡检测试剂盒购自华美生物工程公司.

    1.2方法

    1.2.1细胞培养人卵巢癌细胞SKOV3常规培养在含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培养基中，培养条件为37℃，50 mL/L CO2饱和湿度，待细胞长满瓶底时，2.5 g/L胰蛋白酶消化传代.

    1.2.2MTT法测定不同浓度顺铂在不同时间对SKOV3细胞生长的抑制率取对数生长期的SKOV3细胞，调整细胞密度为5×107/L，接种于96孔板, 200 μL/孔,37℃，50 mL/L CO2培养箱中培养24 h后加药，使顺铂终浓度为10，20，40，80，160 μmol/L,每个浓度设四个平行孔，并同时设不加药物的阴性对照和无细胞的空白对照，分别于作用24，48，72 h后加入20 mmol的MTT溶液，20 μL/孔，继续培养4 h后，吸去上清，加入DMSO，150 μL/孔，振荡器震荡10 min，使结晶溶解完全，用酶标仪(650 BIORAD公司)在490 nm处测量A值，计算细胞增殖抑制率（inhibition rate, IR%）. 绘制顺铂对SKOV3细胞的生长抑制曲线.

    1.2.3脂质体介导寡核苷酸转染SKOV3细胞株

    1.2.3.1寡核苷酸链的设计和合成根据文献［5］合成chk2的反义寡核苷酸链（antisense oligodeoxynucleotide，Adosn: 5′TCCACAGGCACCACTTCC3′）,并同时合成其正义的寡核苷酸链(oligodeoxynucleotide, odn: 5′GGAAGTGGTGCCTGTGGA3′)作为对照. 均采用全硫代修饰，其中部分寡核苷酸链的5′端以FITC标记.

 1.2.3.2实验分组与转染细胞分4组,A：正常组：未经任何处理；B：转染空脂质体组(LP);C：转染chk2正义链组（chk2 odn组）；D：转染chk2反义链组（chk2 Asodn 组）. B至D两组在转染终止10 h后同样用40 μmol/L顺铂处理细胞24 h.

    1.2.3.3转染效率的测定于转染前一日用无抗生素的含10 mL/L胎牛血清的RPMI1640调整细胞密度为2.5×108/L，接种于24孔板，500 μL/孔. 转染当天细胞密度达到90%~95%，并换为500 μL无抗生素无血清RPMI1640培养. 分别取不同量的荧光标记的寡核苷酸链(0.6，0.8，1.0 μg)加到50 μL的RPMI1640中，混匀. 再取2 μL的Lipofectamine2000，加到50 μL的RPMI1640中，混匀. 室温放置5 min后，将分别混有寡核苷酸链和Lipofectamine2000的RPMI1640混合，室温放置20 min（寡核苷酸链与脂质体比值分别为0.6 μg∶2 μL，0.8 μg∶2 μL和1.0 μg∶2 μL）. 将上述混合物加入24孔板中，轻轻混匀，放37℃，50 mL/L CO2培养箱中，培养6 h后将培养基换为500 μL含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640，继续培养至24 h，荧光倒置显微镜下观察转染效率.

    1.2.4Western Blot法检测Chk2蛋白的表达用酶抑制剂法提取细胞总蛋白，并用Bradford比色法作蛋白定量，煮沸5 min使蛋白变性，120 g/L聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，转膜，加入1∶400稀释的鼠抗人Chk2 mAb，室温孵育1.5 h，TBST洗膜3 min，6次. 加入1∶3000稀释的辣根酶标记的羊抗鼠二抗室温孵育1 h，TBST洗膜3 min，6次. ECL(购自Amersham bioscience)显色，X光胶片暴光，洗片，扫描存档.

    1.2.5流式细胞仪检测细胞凋亡收集细胞，调整细胞密度为1×109/L，取1 mL细胞悬液，离心， PBS洗涤3次,加10 μL AnnexinVFITC,轻轻混匀，加入5 μL PI避光室温反应15 min，上流式细胞仪（EPLCS ELITE  COULTER CORPORATION公司）检测.

    1.2.6TUNEL法检测细胞凋亡将SKOV3单细胞悬液接种于24孔培养板培养，使细胞爬于盖玻片，按前述分组处理细胞后捞出盖玻片，多聚甲醛固定，按TUNEL试剂盒说明进行操作.

    统计学处理:实验结果均采用SPSS13.0软件进行方差分析及两两比较. P<0.05为差异有统计学意义.

    2结果

    2.1顺铂对SKOV3细胞的生长抑制作用对照组SKOV3细胞体外生长良好，10，20，40，80，160 μmol/L顺铂对SKOV3细胞均有明显的抑制效应（P<0.05）, 10 μmol/L顺铂作用SKOV3细胞24，48，72 h后的抑制率分别为29.1%，18.2%，50.4%，160 μmol/L顺铂作用SKOV3细胞24，48，72 h后的抑制率分别为78.9%，78.5%，88.4%. 随着时间延长和浓度增加，其抑制作用越来越明显（图1）. DDP作用24 h的IC50值为37.2 μmol/L.

    图1顺铂对卵巢癌SKOV3细胞株生长抑制曲线

    2.2chk2反义寡核苷酸转染SKOV3细胞的效率用FITC标记的寡核苷酸转染SKOV3细胞，24 h后用荧光倒置显微镜观察转染效率，发现DNA/Lipofectamine2000脂质体比率为0.6 μg∶2 μL，0.8 μg∶2 μL和1.0 μg∶2 μL时的转染效率分别为98.2%，98.9%和99.3%，其中DNA/Lipofectamine2000脂质体比率为1.0 μg∶2 μL时转染效率最高（图2）.

    A: DNA/Lipofectamine 2000脂质体比率为0.6 μg∶2μL；B: DNA/Lipofectamine 2000脂质体比率为0.8 μg∶2 μL；C: DNA/Lipofectamine 2000脂质体比率为1.0 μg∶2 μL；A1,B1,C1:光镜检测；A2,B2,C2:荧光倒置显微镜检测.

    图2不同比率的DNA/Lipofectamine2000脂质体转染效率×20

    2.3转染chk2反义寡核苷酸对Chk2蛋白表达的影响Western Blot检测结果显示其灰度值分别为1.26，0.76，0.29，0.06,可见转染chk2反义寡核苷酸可明显抑制Chk2蛋白的表达（图3）. 与空白对照组，空脂质体组和转染chk2正义链组比较差异有统计学意义（P<0.01）.

  A:正常组；B:转染空脂质体组(LP);C:转染chk2正义链组（chk2 odn组）；D:转染chk2反义链组（chk2 Asodn 组）.

    图3chk2反义寡核苷酸对SKOV3细胞Chk2蛋白表达的影响

    2.4转染chk2反义寡核苷酸对SKOV3细胞早期凋亡的影响40 μmol/L顺铂处理各组细胞24 h后，流式细胞仪检测转染chk2反义链组细胞凋亡率为（77.6±1.7）%，明显高于正常组（24.7±1.76）%，空脂质体组（35.6±1.4）%及转染正义寡核苷酸细胞组（47.6±1.2）% （P<0.05）. 说明转染chk2反义寡核苷酸可诱导SKOV3细胞的凋亡增加. TUNEL染色后，转染chk2反义寡核苷酸链后SKOV3细胞在顺铂作用下凋亡细胞数明显高于正常组，空脂质体组和转染chk2正义寡核苷酸链组凋亡细胞数（图4）. 检测结果与Annexin V/PI流式细胞仪检测法获得结果一致.

    A：正常组；B：转染空脂质体组(LP)；C：转染chk2正义链组（chk2 odn组）；D：转染chk2反义链组（chk2 Asodn 组）.

    图4TUNEL法检测顺铂处理24 h后各组细胞的凋亡×40

    3讨论

    由于对卵巢癌仍缺乏有效的早期诊断方法，多数患者确诊时已属晚期，卵巢癌亦成为死亡率最高的妇科恶性肿瘤. 手术治疗后辅以化学治疗是目前卵巢癌的标准治疗方案，然而，肿瘤对化疗药物的耐药常导致治疗失败. 有报道约15%的卵巢癌患者对化疗原发性耐药，至少80%的卵巢癌患者最终形成多种药物联合化疗的耐药. 研究发现，肿瘤细胞的多耐药性以成为恶性肿瘤化疗失败的重要原因之一［1］，因而进行化疗增敏或寻找新的治疗手段具有重要意义.

    chk1/chk2在细胞周期检测点中起重要作用. 国外一些研究表明通过阻断chk1/chk2可以明显增加肿瘤细胞的凋亡［6-8］. 大量研究表明，chk1,2主要在G2/M期检测点发挥作用［9］. DNA受损后，活化的chkl/2磷酸化CDC25 上的Sevr216，使其形成与1433蛋白质结合的位点，从而阻止CDC25 的去磷酸化作用. 如此cdc2因未脱磷酸化不具活性最终影响cdc2与CyclinB构成的活性复合体从而引起G2M期阻滞［10-11］. 卵巢癌细胞对化疗药物的耐药是治疗失败的重要原因. 为了证明chk2是否是卵巢癌增敏治疗的有效靶点，通过反义寡核苷酸杂交技术，合成chk2反义寡核苷酸链，经过杂交，用Western Blot法检测Chk2蛋白在肿瘤细胞中的表达情况. 并用顺铂处理杂交后细胞，通过流式细胞术检测，比较其与其他对照组肿瘤细胞凋亡率的改变情况. 我们的实验结果表明，通过阻断chk2，可明显增加卵巢癌细胞对顺铂的敏感性.

    本研究首先用MTT法检测不同浓度的顺铂在不同时间点对卵巢癌SKOV3细胞的抑制率的变化. 通过本试验，我们了解到顺铂对SKOV3细胞的抑制率随时间和浓度的增加上升. 并计算出DDP作用24 h的IC50值为37.2 μmol/L. 所以我们在后面的实验中均选择用40 μmol/L顺铂处理SKOV3细胞24小时. 并通过检测chk2反义寡核苷酸转染细胞的效率，获得一个最佳的寡核苷酸和脂质体的比例，使实验结果更加稳定可靠. 以上结果表明DNA/Lipofectamine 2000脂质体比率为0.6 μg/2 μL, 0.8 μg/2 μL和1.0 μg/2 μL时的转染效率均接近100%. 我们选择寡核苷酸/Lipofectamine 2000脂质体比率为0.8 μg/2 μL来转染SKOV3细胞. 转染后，用Western Blot法检测各组SKOV3细胞的Chk2蛋白表达情况，发现转染chk2反义寡核苷酸链组chk2蛋白的表达明显降低. 用40 μmol/L顺铂处理SKOV3细胞24 h后，用流式细胞仪及TUNEL法检测显示转染chk2反义寡核苷酸链组SKOV3细胞的凋亡率明显增加（P<0.05）. 证明了阻断chk2来增加宫颈癌对顺铂敏感性的有效性.

    综上所述，采用反义寡核苷酸可以有效地抑制Chk2蛋白的表达，并增加顺铂诱导的SKOV3细胞的凋亡. 因此，本试验结果可以证明chk2可以作为卵巢癌增敏治疗的有效靶点.

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