微囊藻毒素LR促肝癌过程p53、p16基因mRNA表达

作者：胡志坚, 陈华, 庞春艳, 郑玲, 林奇英          【关键词】  藻毒素类;,γ

　　摘要:目的  探讨微囊藻毒素LR(MCLR)促肝癌的分子机制。方法   采用二阶段致癌理论建立中期试验动物模型,γ谷氨酰转肽酶(γGT)染色检验MCLR的促癌作用,并以RTPCR结合图像分析技术精确测定大鼠肝脏p53和p16基因的表达情况。        结果        (1)MCLR在促大鼠肝癌过程中能显著增加γGT阳性率。(2)MCLR在促大鼠肝癌过程中能显著增加大鼠肝脏p53 mRNA表达强度,而对p16 mRNA表达强度没有影响。结论 调节p53表达可能是MCLR促癌过程的重要机制。

　　关键词: 藻毒素类; γ谷氨酰转移酶; 毒素类; 基因,p53; 基因,p16; 肝肿瘤

　　he Expression of p53 and p16 in the Course of MicrocystinLR Inducing of Liver Tumor

　　Hu Zhijian, Chen Hua, Pang Chunyan, Zheng Ling, Lin Qiying

　　1.Public Health School, Fujian Medical University, Fuzhou 350004, China

　　2.Institute of Virology, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China

　　ABSTRACT: Objective  To explore the molecular mechanism of microcystinLR(MCLR) inducing of liver tumor.        Methods Acording two stagemediumterm theory to set up the animal model, and biochemistry technique to detect the carcinogenesis of the model.RTPCR technique and image analysis were used to study the mRNA expression of the p53 and p16 in the course of inducing tumor. Results (1)MCLR can enhance the positive reaction of γGT. (2)MCLR increased the expression of p53, and have not effect on the expression of p16. Conclusion (1)MC can induced liver tumor formation strongly. (2)The high expression of p53 may play an important role in the carcinogenesis of MCLR in liver.

　　KEY WORDS:  microcystins; γglutamyltransferase; toxins; genes,p53; genes,p16; liver neoplasms                　　当前随着全球环境的不断恶化,水体中有毒的藻类对人类健康的影响也越来越受人们的关注。饮水中以微囊藻毒素(microcystin,MC)为代表的藻类毒素已被公认为引起肝癌的三大主要环境因素之一[1]。MC是一种特征性的肝毒素,其中以分布广且肝毒性明显的微囊藻毒素LR(MCLR)为其主要代表物。已有研究表明,福建同安肝癌高发与存在MCLR有关[2]。许多研究表明，基因表达的改变与肿瘤发生密切相关,为进一步了解MCLR在肝肿瘤发生过程中的作用和机制,笔者选择与调节细胞周期密切相关的p53和p16基因进行研究,通过分析它们在藻类肝毒素促肝癌过程mRNA表达的变化,从而进一步明确MCLR的促癌的机制。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 动物        　　Wistar大鼠(中科院上海实验动物中心;合格证号:中科动管第005号)5周龄,雄性,45只。

　　1.1.2 试剂      

　　二乙基亚硝氨(DEN,南京土壤研究所),200 mg/kg腹腔注射。MCLR纯毒素(美国Sigma公司),20 μg/kg腹腔注射。RNA提取用Trizol mRNA提取试剂盒(美国Invitrogen公司),cDNA合成用试剂盒(SuperScriptTM FirstStrand Synthesis Systern for RTPCR,美国Invitrogen公司)。γL谷氨酰α萘胺、双甘氨肽和固浆紫(上海化学试剂公司)。

　　1.1.3　藻水       

　　在9月份藻类繁殖高峰时用25号浮游生物网采集福建同安汀溪水库的藻细胞,经镜检60%为微囊藻。MC培养基培养,取其培养液作样本,经上海第一医科大学预防医学研究所ELISA法检测,该藻水中含MC 529.656 ng/L。

　　1.2 方法

　　1.2.1 二阶段试验       

　　大鼠随机分成4组,正常饲养1周后,3组给予DEN 200 mg/kg腹腔注射1次,1组等容量生理盐水腹腔注射(空白对照组)。第3周末,4组大鼠均行2/3肝切除。第4~10周,DEN+纯毒素组MCLR纯毒素20 μg/kg腹腔注射,DEN对照组和DEN+藻水组等容量生理盐水腹腔注射。在此期间,DEN+藻水组饮用藻水,另3组饮用自来水。DEN对照组与DEN+纯毒素组各1只死亡。第10周末处死动物,取肝脏做HE染色、γGT染色和RTPCR。

　　1.2.2 γGT染色 

　　取γL谷氨酰α萘胺和双甘氨肽各20 mg溶解于0.1 mol/L(pH 7.2)磷酸缓冲液16 mL作为甲液;称取固浆紫24 mg溶解于生理盐水24 mL作为乙液。甲乙两溶液混合过滤制备成染液,将染液倒入染色缸并置于37 ℃水浴10 min,将冷冻肝组织切片与水浴中的染液作用30~60 min,取出用蒸馏水清洗,然后在2%CuSO4浸洗2 min,蒸馏水再次漂洗。最后苏木精染色,甘油明胶封固。以正常小鼠肾脏作阳性对照,在光镜下观察肝细胞浆,以染成桔红色为阳性。

　　1.2.3 反转录聚合酶反应       

　　以组织标本100 mg∶TrizolTM 1 mL的比例将肝癌组织溶于TrizolTM中,立即于室温研磨混匀,加入氯仿200 μL剧烈震荡15 s,室温下静置2~3 min,于4 ℃、7000 r/min离心15 min。提取上清即为肝癌组织的总RNA,经SuperScript TrizolTMⅡRT反转录为cDNA。取cDNA 2 μL于25 μL反应体系中进行PCR反应(引物与条件见表1)。每个反应包括不加cDNA模板的阴性对照。PCR反应完成后,取PCR产物5~10 μL进行电泳鉴定,于1.5%~2%琼脂糖凝胶,10 V/cm凝胶的电压下电泳。凝胶成像系统拍照,ImagePro Plus图像分析软件对目的基因及内参物电泳条带进行积分光密度(integral opticaldensity,IOD)测定,用目的基因吸光度与GAPDH光密度比值代表目的基因的相对表达含量。表1PCR扩增引物（略）

　　1.3 统计学处理       

　　利用SPSS 12.0统计软件的精确概率法、方差分析、LSD法对数据分析。

　　2 结果

　　2.1 肝组织病理形态改变       

　各组肝脏表面光滑,经2/3切肝后,残余肝叶均代偿性增大至接近原肝脏体积。纯毒素组肝边缘稍有变纯,质地变硬,体积略小。镜下见:纯毒素组肝脏内出现大小不一的嗜酸、透明、混合肝细胞增生灶,灶内肝细胞混浊肿胀,有水样变性及点状坏死,还可见少量双核、核深染、巨核肝细胞。个别区域间质炎性细胞浸润(图1);DEN对照组和DEN+藻水组病灶数明显低于DEN+纯毒素组;空白对照组未见组织学改变。

　　2.2 MCLR对肝脏的促癌作用       

　　各组γGT染色的阳性率有统计学意义(P<0.01)。组间两两比较(精确概率法)结果显示,DEN+纯毒素组γGT染色的阳性率显著地高于其他组(P<0.05),表明纯毒素对肝癌的发生具有促进作用。DEN+藻水喂养组虽然γGT阳性率比DEN对照组高,但无统计学意义(P>0.05,表2)。表2各组γ谷氨酰转肽酶染色结果（略）

　　2.3 MCLR对肝脏p53、p16 mRNA表达的影响       

　　利用ANOVA(各组间的方差齐)对各组各指标均数进行检验：(1)p53 mRNA表达强度各组差别有统计学意义(F=6.532,P<0.01)。利用LSD法对各组均数之间进行两两比较,DEN+纯毒素组mRNA表达强度高于其他3组,且有统计学意义(P<0.05),其他各组间差别无统计学意义;(2)p16 mRNA表达强度的差别无统计学意义(表3)。表3 各组p53、p16 mRNA的表达（略）

　　3 讨论

　　3.1　MCLR在动物肝癌前病变模型中的作用       

　　按二阶段致癌理论设计的中期动物试验模型是一种评价环境化合物的致癌或促癌作用有效动物模型,这一测试模型是Ito等经过长期的摸索后才得以建立[3]。本次研究中MCLR是在DEN启动下并经2/3肝切除激活肝细胞增殖后,进行染毒,其作用阶段为肝癌的促进阶段。显微镜下观察γGT组织化学检测结果显示(1)HE染色:纯毒素组肝组织普遍存在有病变程度不同的嗜酸、透明、混合肝细胞增生灶。DEN对照组、DEN+藻水喂养组虽也可观察到病灶,但数量和大小都比DEN+纯毒素组少,病变的强度也较轻。空白对照组肝脏未见明显的损伤,说明MCLR可增加肝脏的受损程度;(2)γGT是属于转移酶类,在体内的主要的功能是参与“γ谷氨酰循环”,能催化γ谷氨酰半胱氨酰甘氨酸三肽中的γ肽链水解。γGT与组织的氨基酸和肽的调节、分泌、吸收、转运、合成有关。主要分布于肾、肝、肠、胰等。γGT在正常情况下大鼠的肝脏经γGT染色成阴性,在胎肝、肝癌发生时表达增强,是目前公认的肝癌癌前病变的指标[4]。本次实验结果DEN+纯毒素组γGT阳性率显著高于其他组,而且在病变灶中染色特别深,说明MCLR可显著增加DEN+纯毒素组γGT染色阳性率,进一步证实了MCLR具有明显的促肝癌作用。同时也证明了本模型建立是成功的。                　　在实验中,DEN+藻水组尚未明显表现出其促癌作用原因可能有两方面,一方面藻水中的毒素含量远低于DEN+纯毒素组,另一方面其染毒的途径是经口,而文献报道经口的毒性只是腹腔注射的1/30[5],故在中期模型中尚不能显示出其明显促癌效应,但也可看出该组γGT阳性率已有增高趋势。

　　3.2 MCLR的促癌机制       

　　细胞周期的调控失衡是癌变的一个作用机制,其中G1/S期的转换是细胞周期中比较敏感的时期,易受内外因素的影响,导致细胞周期的改变,决定继续增殖还是退出细胞周期。因此本课题针对调控细胞周期起决定性作用的p53和p16 mRNA表达强度进行研究。                　　p53位于人染色体17pl3,野生型p53通过调节细胞周期或诱导细胞凋亡而发挥其抗肿瘤的作用。但突变型p53则丧失上述功能,并且部分突变型p53获得促增殖、转化致癌潜能,并能抑制细胞凋亡。正常情况下p53蛋白以潜在形式存在并维持低水平。当DNA受损时,p53即被活化表达增强,进一步通过直接或间接影响其下游p21waf1基因和细胞周期素依赖性激酶(CDK)表达,使细胞周期停滞,以便进行DNA修复,若修复失败则细胞凋亡[6]。笔者研究结果显示,DEN+纯毒素组p53 mRNA表达强度显著高于其他组,可能是由于毒素对DNA的损伤,从而促使p53表达增强,也有可能这种表达的增强是由于p53受毒素的损伤而发生突变引起的。p16又称为多种肿瘤抑制基因,其作用是通过抑制CDK4活性或CDK4与cyclin复合物的活性,使之不能解除pRb基因对转录因子的抑制作用,从而使细胞停滞在G1期而不进入S期,达到其负向调控作有,有利于受损的DNA的修复[7]。但在笔者研究中p16的mRNA表达各组间差别无统计学意义,提示MCLR在促肝癌过程中对p16 mRNA表达可能无影响。

　　参考文献：

　　[1]俞顺章,董传辉,张幼辰. 我国两种生物毒素与肝癌黄曲霉毒素与藻类毒素[J]. 卫生研究,  1998,27(增刊):84.

　　[2]孙昌盛,陈华,薛常镐,等. 同安水环境藻类及藻类毒素分布调查[J]. 中国公共卫生, 2000,16(2):147148.

　　[3]Ito N,Tamano S,Shirai T. A mediumterm rat liver bioassay for rapid in vivo detection of carcinogenic potential of chemicals[J]. Cancer Sci,2003; 94(1):38.

　　[4]沈卫东,黄介飞. 肝癌特异性GGT诊断肝癌的研究进展[J]. 世界华人消化杂志, 2005,13(9):11191122.

　　[5]Fawell J K,Mitchell R E,Everett D J,et al. The toxicity of cyanobacterial toxins in the mouse:I microcystinLR[J]. Hum Exp Toxicol, 1999,18(3):162167.

　　[6]Mazzatti D J,Lee Y J,Helt C E. p53 modulates radiation sensitivity independent of p21 transcriptional activation[J]. Am J Clin Oncol, 2005,28(1):4350.

　　[7] Serrano M,Hannon G J,Beach D. A new regulatory motif in cellcycle control causing specific inhibition of cyclinD/CDK 4[J]. Nature,1993,366(6456):634635.　　　　基金项目:  福建省自然科学基金资助项目(C0210011)

　　作者单位: 1.福建医科大学公共卫生学院, 福州        350004

　　　　     　2.福建农林大学 病毒研究所, 福州        350002

　　作者简介: 胡志坚(1969~),副教授,医学博士