COX-2及VEGF在乳腺癌中的表达及临床意义

作者:曹飞麟,朱敏,谢伯剑,甘梅      作者单位：浙江省台州医院，浙江 临海 317000       【摘要】  ［目的］ 探讨环氧化酶2(COX-2)及血管内皮生长因子（VEGF）在乳腺癌中的表达及其临床意义。［方法］ 应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)，检测了96例乳腺癌患者癌组织及癌旁组织中COX-2和VEGF的表达。［结果］ COX-2 mRNA和VEGF mRNA分别在87.50%和83.33％乳腺癌组织中表达，而仅在16.67%和31.25%癌旁组织中表达，癌组织与癌旁组织COX-2 mRNA和VEGF mRNA的表达差异有显著意义。［结论］ COX-2 mRNA、VEGF mRNA 在乳腺癌组织中明显增高。COX-2的表达同VEGF的表达密切相关。

   【关键词】  乳腺肿瘤

    The Expression of Cyclooxygenase-2 and VEGF in Breast Cancer and Its Significance

    CAO Fei-lin, ZHU-Min, XIE Bo-jian, et al.

    (Taizhou Hospital of Zhejiang Province, Linhai 317000, China)

    Abstract: ［Purpose］ To investigate the expression of cyclooxygenase-2 (COX-2), vascular endothelial growth factor (VEGF) in breast cancer and its clinical significance. ［Methods］  The expression of COX-2 and VEGF in 96 cases of breast cancer tissues and cancer adjacent tissues were detected by reverse transcription-PCR. ［Results］ Expression of COX-2 mRNA and VEGF mRNA was 87.50% and 83.33% in breast cancer tissues; 16.67% and 31.25% in cancer adjacent tissues respectively. The expression of COX-2 mRNA and VEGF mRNA was significantly different between cancer tissue and cancers adjacent tissue. ［Conclusion］ Expression of COX-2 and VEGF mRNA in breast cancer is significantly increased. Expression of COX-2 is closely correlated with expression of VEGF .

    Key words: breast neoplasms; cyclooxygenase-2; VEGF; reverse transcription polymerase

    chain reaction

    环氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)是一种多功能的蛋白质，在多种恶性肿瘤组织中，COX-2的表达增高,它与恶性肿瘤发生发展密切相关。我们采用RT-PCR和免疫组化法检测了96例乳腺癌组织中COX-2和VEGF的表达，探讨COX-2、VEGF在乳腺癌中的表达情况及其相关性，以及COX-2选择性抑制剂用于乳腺癌高危人群化学预防和治疗的可能性。

    1   材料与方法

    1.1   研究对象

    收集台州医院肿瘤外科2002年12月至2003年5月因患乳腺癌行根治性手术并经病理证实的肿瘤标本及配对的癌旁组织96例。同时留取石蜡标本，行HE及免疫组织化学染色。年龄23~58岁，平均42.5岁。组织类型：浸润性导管癌80例，髓样癌8例，黏液腺癌4例，导管内癌4例。肿瘤分期：Ⅰ~Ⅱ期76例，Ⅲ~Ⅳ期20例。

    1.2   主要试剂

    TRIzol (Invitrogen公司)，M-MuLV逆转录酶，RNA酶抑制剂(MBI，Ferments)，Taq酶（Generay公司）COX-2、VEGF、β-actin引物(上海生物工程公司合成)；鼠抗人COX-2蛋白及VEGF抗体的单克隆抗体购自福建生物技术有限公司；COX-2扩增产物为488bp，上游引物: 5′-TCAAGTCCCTGAGCATCTAC-3′；下游引物:5′-CATTCCTACCACCAGCAACC-3′；VEGF引物序列：上游引物：5′-GCTCTACCTCCACCATGCCA-3′；下游引物：5′-AGCTCATCTCTCCTATGTGC-3′，β-肌动蛋白扩增产物为619bp，上游引物:5′-CGCTGCGCTGGTCGTCGACA-3′；下游引物:5′-GTCACGCACGATTTCCCGCT-3′。

    1.3   实验方法

    RT-PCR检测COX-2 mRNA及VEGF mRNA表达：(1)提取 RNA：取新鲜乳腺癌组织50mg~100mg在液氮中速冻，玻璃匀浆器中彻底匀浆，按Trizol试剂盒说明书裂解抽提总RNA，异丙醇沉淀，溶于DEPC水。紫外分光光度计测定A260/280比值均在1.75~2.0范围之内。(2)逆转录合成cDNA：各取2μg总RNA，逆转录酶 M-MULV催化合成cDNA，再取cDNA0.1μg作VEGF和COX-2的PCR扩增。（3）检测COX-2 mRNA表达：以同一cDNA为模板，在25μl反应体系内扩增COX-2和β-肌动蛋白。循环条件：95℃ 2min,94℃ 45s，53.2℃45min，72℃ 1min，循环35次。最后72℃延伸10min。取5μl PCR产物于2%琼脂糖凝胶电泳，EB（溴化乙啶）染色，凝胶成像分析。⑷检测VEGF mRNA表达：循环条件:95℃ 2min，94℃ 45s，51.5℃ 45min，72℃ 1min，循环35次。最后72℃延伸10min。取5μl PCR产物于2%琼脂糖凝胶电泳，EB（溴化乙啶）染色，凝胶成像分析。

    免疫组化染色及结果判断：采用免疫组SP法，按说明书操作。病理组织切片我院两位病理学专家阅片作出病理诊断。

    RT-PCR结果判定：PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳，EB（溴化乙啶）染色，并用标准PCR Marker Ladder对照，电泳后凝胶成像分析。阳性结果为：在488bp（COX-2 mRNA）和619bp（β-actin）和320bp（VEGF mRNA）处出现条带。

    1.4   统计学处理

    采用卡方检验和四格表确切概率法。检验标准α=0.05。

    2   结   果

    2.1   COX-2和VEGF mRNA及其蛋白表达情况

    96例癌组织中有84例检测到了COX-2 mRNA的表达，阳性率是87.50%；而癌旁组织中只有16例COX-2 mRNA的表达，阳性率为16.67%。两者比较差异有显著性。COX-2的表达位于乳腺肿瘤上皮细胞的胞浆内，54.17%的肿瘤组织见阳性染色（见图1）。6.25%(6/96)的癌旁组织见不同程度的阳性染色，两者比较差异有显著性，见表1。VEGF mRNA在乳腺癌中阳性率是83.33%(80/96)，而在癌旁组织中阳性率是31.25%(30/96)，两者比较差异有显著性；VEGF的表达位于乳腺肿瘤上皮细胞的细胞膜或细胞质，75.0%（72/96）乳腺癌中存在VEGF阳性表达（图2），与癌旁组织（25.0%，24/96）相比差异有显著性（表1）。

 2.2   COX-2 与VEGF mRNA及其蛋白在乳腺癌组织中表达的相互关系

    COX-2 mRNA及其蛋白在乳腺癌组织中的阳性表达与VEGF mRNA及其蛋白的阳性表达呈正相关（P<0.05），COX-2 mRNA及其蛋白的阳性表达水平越高，其相应的VEGF mRNA及其蛋白的阳性也越高。见表2、3。

    3   讨   论

    COX-2是前列腺素合成过程中重要的限速酶。COX-2表达与肿瘤细胞的增殖、凋亡和血管形成密切相关[1]。目前一系列研究发现COX-2在人的很多癌前病变和恶性肿瘤中高表达，如胃肠上皮化生、Bareet食管、胃癌、结肠癌、食管癌、肝癌、膀胱癌、口腔癌和非小细胞癌、前列腺癌、鼻咽癌和乳腺癌等。COX-2选择性抑制剂能抑制大鼠乳腺肿瘤的发生。Liu等在转基因小鼠模型中发现过度表达COX-2的乳腺上皮细胞可发生癌变，表明COX-2的过度表达足以诱导乳腺肿瘤的发生，因此，进一步探讨COX-2在人乳腺癌发生发展中的作用具有重要意义。本研究显示，87.5％乳腺癌COX-2 mRNA表达，54.2%COX-2蛋白呈阳性表达，而在癌旁组织中仅有16.67％可检出COX-2 mRNA表达，6.25％COX-2蛋白呈阳性表达；两者比较差异有显著性，提示COX-2在乳腺癌的发生、发展中起着重要的作用。COX-2的作用产物前列腺素可以促进肿瘤的新生血管生成，刺激肿瘤细胞增殖，抑制肿瘤细胞凋亡，促进肿瘤的浸润和转移，抑制机体的免疫反应。

    血管的生成在肿瘤的发生发展中起重要作用。目前已知的刺激血管内皮细胞增殖的因子有VEGF、BFGF、PDGF等，其中血管内皮生成因子(VEGF)是一种高度特异性的有丝分裂原，能直接刺激新生血管的形成；被公认为是最重要和最强的促血管生成因子。同时VEGF也是一种血管通透性诱导因子，可增加微静脉和小静脉的通透性，是已知最强的血管通透剂。Anthony等通过原位杂交法检测46例乳腺癌活检标本，发现肿瘤细胞内的VEGF表达与组织分化、远处转移密切相关，与乳腺癌的MVD呈显著性相关，VEGF蛋白在乳腺癌中高表达提示乳腺癌形成过程中伴随VEGF的高分泌，VEGF与乳腺癌的发生及生长有关。淋巴转移的发生也有赖于原发肿瘤新生血管的形成。我们在乳癌腺组织中也检测到VEGF蛋白和VEGF mRNA都有高表达，其阳性率分别为75%和83.33％，明显高于癌旁正常组织，同以往报道相符。

    郭贵龙等[2]研究发现COX-2的表达与MVD明显正相关，表明COX-2可以促进肿瘤新生血管的形成。机制可概括如下：①诱导肿瘤细胞产生VEGF；②肿瘤组织产生的PGE2，PGF2及TXA2等直接或间接促进血管生成；③促使基质金属蛋白酶（MMPS）表达激活血管生成素；④刺激Bcl-2的表达来抑制内皮细胞凋亡，促进血管生成；⑤缺氧诱导COX-2促进肿瘤血管的形成。我们研究发现COX-2和VEGF表达明显相关，过度表达COX-2的乳腺癌细胞可能诱导VEGF产生，从而促进肿瘤新生血管的形成。本研究中乳腺癌组织中的COX-2表达与VEGF的表达呈正相关，提示COX-2参与血管形成，可能与诱导VEGF的表达有关。因此，在乳腺癌中COX-2和VEGF共同参与乳腺癌的发生、发展及转移。

    目前发现人类多种恶性肿瘤及癌前病变组织中有高表达的COX-2，且阳性率较高，这为肿瘤的化学预防和治疗提供了新的思路和模式，学者们对NSAIDS用于化学预防乳腺癌也产生了极大的兴趣。研究表明连续5年每日口服阿司匹林、优布芬，乳腺癌的发生率下降约40%~50%。Harris等[3]研究发现选择性COX-2抑制剂celecoxib可以明显延迟大鼠DMBA诱导的乳腺癌发生，并且较非选择性COX-2抑制剂优布芬更为有效。目前，抗血管生成药物Bevacizumab已被美国FDA批准用作转移性直肠癌的一线治疗药物，Fairooz F等在联合使用Bevacizumab治疗转移性结直肠癌后证实反应率、生存率及平均寿命延长均较单独使用Fluorouracil有统计学意义。因此，进一步探讨COX-2和VEGF在人乳腺癌发生发展中的作用及其两者间具体的作用机制具有重要意义，或许应用COX-2抑制剂或用VEGF抗体将有望成为预防与治疗乳腺癌的新方法。

【参考文献】[1] Ali-Fehmi R, Morris RT, Bandyopadhyay S, et al. Expression of cyclooxygenase-2 in advanced stage ovarian serous carcinoma: Correlation with tumor cell proliferation, apoptosis, angiogenesis, and survival[J]. Am J Obstet Gynecol, 2005, 192(3):819-825.

[2] 郭贵龙, 姚榛祥. 环氧化酶-2在人乳腺癌中的表达及对肿瘤血管形成的影响[J]. 中华外科杂志, 2004, 42（20）:1271-1272.

[3] Harris RE, Alshafie GA, Abou-Issa H, et al. Chemoprevention of breast cancer in rats by celecoxib, a cyclooxygenase-2 inhibitor[J]. Cancer Res,2000,60（8）:2101-2103.