类釉质样结构合成及其微观形貌分析

　　目前已经明确组成人类釉质的纳米棒样磷灰石晶体的平均横截面直接为25-100nm.延c轴长约100-100um。典型的釉柱结构的平均横截面为5μm，跨越釉质全层长1-2mm，探索仿牙齿结构的方法的研究已经引起了一些学者的注意。但是关于体外合成牙体硬组织的研究较少，早期有氟处理技术，亚稳态的含钙、磷的矿化液等;近期纳米磷灰石晶体或含蛋白的纳米磷灰石晶体在牙釉质表面沉积等方法也是研究的热点。虽然以上方法有些隐含了仿生构建牙釉质的思路方法，但是获得的磷灰石晶体在形态、大小或组装上与釉质结构有较大差距，令人不甚满意。近年来，随着生物、医学、化学等各学科的交叉及综合，使应用化学方法获得具有生物学功能的医学仿生材料成为可能。　　1材料与方法　　1.1实验材料NaH2P0}·2H2O(分析纯);NaF(分析纯);Ca(N0.3)z·4H2O‘分析纯);浓氨水(分析纯);无水乙醇(分析纯);浓盐酸(分析纯)以上试剂均由北京化工厂提供。乙二胺四乙酸二钠钙，水合(分析纯)，由中国医药(集团)上海化学试剂公司提供。　　1.2实验仪器HJ一6型磁力加热搅拌器(金坛市荣华仪器有限公司);SartoriousBS1245电子天平(北京Sartoriou、仪器系统有限公司);DHG-9070B型电热恒温鼓风干燥箱(上海森信实验仪器有限公司);KQ3200DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);PHS2一3C精密pH计(上海雷磁仪器厂);高压蒸汽灭菌锅(江阴滨江医疗设备厂);日本JEOL-6700场发射扫描电镜(SEM)观察产物形貌。　　1.3实验方法　　1.3.1人类釉质样本及其他基板制备将去净软垢、牙石和软组织的新近拔除用硬组织切片机切割为。0.5cmX0.5cmX0.2cm大小的年轻后牙，以及备成3mmX3mm的锌板、硅板、云母板置于10%甲醛中固定24-}-48h，用蒸馏水反复冲洗、自然干燥后浸于3700磷酸轻酸蚀(15s),蒸馏水反复冲洗后自然干燥备用。　　1.3.2氟磷灰石晶体合成在不断搅拌的水溶液中加人乙二胺四乙酸二钠钙(EDT八一C:a-Na)和磷酸二氢钠合一水(NaH0POk·H.}O).使2种原料浓度分别为0.25mol/I和。.15mol一工一调节pH值为J.5;加入氟化钠(NaF)使其浓度为0.05mol工;继续搅拌悬浮液1h后于120℃反应20h.最终的悬浮液被离心并用去离子水和无水乙醇交替清洗3次，烘箱干燥备用。　　1.3.3牙表面及其他基板表面氟磷灰石晶体棒膜的生长将处理过的牙片及硅、及锌、云母板加人100mI新鲜配制的EDTA-Ca-Na:/NaH2P0·Hz0/NaF混合液，之后于1200C水热反应20h,冷却取出后用去离子水及乙醇冲洗，在扫描电镜分析前在干燥箱中干燥备用。　　2结果和讨论　　2.1反应时间对晶体形貌的影响形貌通过SEM进行表征.见图1。图la示经过轻酸蚀后的人类釉质表面以及组成釉质的晶体的横剖面，可见典型的釉柱样结构，横截面直径约5Cm，成束的晶体彼此平行排列;1b是纵剖面的图示，可估计釉柱长超过几十微米;图lc示组成釉柱的晶体的放大图像，这些晶体横截面约80nm，延c轴长约1μmFA晶体的形态随水热时间的延长发生一系列的变化.见图2。在早期阶段，室温下，悬浮液由非结晶的鳞片和球样结构结构组成(2a)。但水热lOmin后非结晶的沉淀物几乎全被梭样结构所替代.并且棒样结构更加明显，样品已有择向生长的趋势(2b)。水热更长时间后.只能见到棒样结构。2c-2g示随水热时间延长，晶体从梭样结构(2c,2d,2e)到清晰一可见的显微晶体(2f,2g)。具有典型磷灰石六角形结构的清晰结构在水热10h后形成(2f,2g)。高倍SEM下观察棒样结构由许多互相平行排列的小晶体组成(4.2h>，并且具有典型的磷灰石晶体结晶.　　合成氟磷灰石的形体随水热时间延长从空心球到梭样结构，最终成为清晰可见的晶体。当NaF与EDTA-Ca-Na:以及IaHPO、在室温混合后短短几分钟就形成悬浮液，这可能是由于钙离子的作用(钙离子从含磷酸根和氟离子的EDTA-Ca复合物中释放)可致形成两种晶体:一种是热力学稳定的氟磷灰石，或乏钙氟磷灰石，两者皆为棒样结构，具有六边形截面和长的c轴叼。另一种是弱热力学稳定的非晶态氟化磷酸钙(AFCP).该物质动力学上为降低表面能以球形形式存在，且趋于存在于较低温度、自由钙离子少、磷酸根离子和氟离子充足的溶液，而实验初始阶段EDTA-Ca-Na:可以牢固的鳌合钙离子，限制其在溶液中的释放。随着反应进行，温度逐渐升高，越来越多的钙离子从EDTA-Ca-Na:释放，从而亦使无定形AFC'P转变为热力学更加稳定的FA或乏钙FA，直至所有的AFCP反应完全，成核阶段完成。当所有的AFCP核被释放后，由于球形的表面积大，结构不稳定，小的多晶体溶解、彼此融合，从而在大的棒样FA或乏钙FA晶体上发生再沉积，此过程称为swald熟化过程。根据Ostward熟化机理，FA棒样晶体具有聚集到一起的趋势，肩并肩形成一束，由于在沿棒的长轴方向比其末端具有更强的范德华力，一个长而大的氟磷灰石纳米棒经过快速生长可以作为主导晶体，在束的中央，其它小的纳米棒紧密平行排列在主导晶体的表面，从而形成梭样结构。随水热时间的延长，所有的EDTA-Ca复合体中的钙离子前体被耗尽，束停止长长，成束的晶体相互融合，具有高表面能的小尖分枝末端溶解，并且趋向于填补束状结构的扭曲和痕迹，从而形成大的清晰可见的六角形晶体。　　2.2不同基板生长的晶体形貌及排列图3示温和水热条件下典型的棒样晶体在不同基板上的生长J晴况。3a是牙釉质垂直表面生长的晶体层，其大小一致、排布均匀，与釉质表面呈垂直方向生长。横截面直径约300nm，延c轴长10}m，形态学观察验证所形成的物质是良好的结晶体;3b是在处理过的锌板表面排列的晶体膜，大小较一致，排列均匀，与基板表面呈垂直方向生长。横截面直径约1gym,延c轴长约10cm;云母板上生长的晶体(3c)大小一致，但排列较稀疏，大体垂直于基板表面生长，横截面直径约1μm，延c轴长约8m;硅板表面获得的晶体更大些(3d)横截面直径可达3μm，延c轴长约20μm。　　大面积的有序的晶体层在基板表面的形成具有相近的生长速率，并且随着晶体的生长，延C轴的紧密生长模式迫使棒样晶体彼此平行排列，而且高度取向的氟磷灰石膜沉淀在基底，这些薄层与人类釉质中所见相近。　　这些晶体被沉积到不同基板上后形成大面积的有序结构，晶体横截面1一3μm，长约20m，组成晶体的晶须横截面直径约200nm，长度自几微米到几十微米不等。而沉积于牙上的晶体尽管能够彼此平行排列，但是不能互相融合成为棱柱样结构，考虑可能是由于牙的粗糙表面使晶体成核距离较远，从而影响彼此间的融合。　　IijimaMeta报道釉蛋白能够自组装到微带中并在牙釉质发育时控制磷灰石晶体的生长方向和长度上发挥重要作用。笔者工作显示釉质独特的棱柱结构的形成不需要蛋白质的辅助，只需棒样磷灰石晶体相互间的纯粹的理化相互作用。这种棱柱样结构，无蛋白质的存在但是稳定。这也是及时釉蛋白在成熟釉质中退化，其结构仍能保持坚固的原因。　　而这些蛋白质很有可能是在釉质结构的早期发育阶段起重要作用。　　实验将氟磷灰石晶体膜负载不同的基板上，但只有硅板可以得到类釉质样膜，其他基板可以支持氟磷灰石晶体的生长和定向，但是不能得到紧密排列的六棱柱样结构。因此，釉柱样结构的生长不但受晶体相互作用的控制，而且很大程度上取决于其生长的基板，原因不明。　　3结论　　在温和水热条件下采用非细胞的方法重生釉质特殊结构。重建层的显微构造类似于自然釉质。该工作显示可在不用任何细胞和蛋白质的情况下，形成特殊无细胞的釉质结构，并与当前干细胞的再生药物研究形成了互补，同时再生层FA的引人亦可帮助抗龋。便宜方便的再生方法可以在口腔临床中找到许多新的应用.如作为传统牙体修复材料的辅料直接修复受损釉质，或作为窝沟封闭剂用于防龋等。关于反应条件，仍然具有局限性，针对将来运用于临床的目标，仍需使条件更温和，并且排列更紧密。　　参考文献　　K.Yamagishi, K.Onuma, T.Suzuki, ct al.  Asynthetic en-amel for rapid tooth repair[J].Nature. 2005.433，819.　　田鳗.陈治清，彭敏，等[J]四川医学，2010, 31(9)，1222一1213.　　Fowler CE, Li M, Mann S, et al. Influence of surfactant as-sembly on the formation of calcium phosphate materials一Amodel for dental enamel formation [J]. J Mater Chem, 2005，15:3317一3325