IL12在牙龈卟啉单胞菌脂多糖促泡沫细胞形成过程中的作用

　　作者：闫福华1,吴春芳1,李厚轩1　　作者单位：1.福建医科大学 附属口腔医院，福州 350002;2.遵义医学院 口腔医学系，遵义 563003

　　【摘要】 目的 观察白细胞介素12(IL12)预刺激在牙龈卟啉单胞菌脂多糖(P.gingivalis LPS)促泡沫细胞形成过程中对细胞因子的影响。 方法 用氧化低密度脂蛋白(oxLDL)将人THP1单核细胞来源的巨噬细胞诱导48 h形成泡沫细胞。在巨噬细胞和泡沫细胞培养液中分别加入IL12作用2 h后，巨噬细胞培养液中加入oxLDL和 P.gingivalis LPS，泡沫细胞培养液中加入P.gingivalis LPS。使用ELISA法检测培养液上清中IL1β和肿瘤坏死因子α(TNFα)的水平，实时定量PCR检测细胞内IL1β、IL10、IL12和IL18 mRNA的转录水平。 结果 在泡沫细胞形成过程中，IL12预刺激可以降低培养液上清内TNFα水平，降低细胞内IL10和IL12 mRNA转录水平;泡沫细胞受P.gingivalis LPS刺激过程中，IL12预刺激可以增加培养液上清IL1β水平，减少细胞内IL18 mRNA的转录水平，增加IL10 mRNA的转录水平。 结论 IL12预刺激影响P.gingivalis LPS促泡沫细胞形成过程中炎症细胞因子的转录和分泌。

　　【关键词】 脂多糖类,卟啉单胞菌,牙龈,白细胞介素12,巨噬细胞; 低密度脂蛋白类

　　白细胞介素12(interleukin 12,IL12)主要是由单核/巨噬细胞分泌表达的一种细胞因子，其相对分子量为75 KD，是由不同基因编码的2个亚基p35和p40通过二硫键结合在一起的异二聚体。IL12具有广泛的生物学活性，它能促进NK细胞和T细胞的增殖、活化及细胞毒作用;促进巨噬细胞的活化，并诱导多种细胞因子的产生;调节Th0细胞向Th1细胞分化增殖，增强细胞的免疫功能[1]。有研究表明，通过注射IL12于LDLr/小鼠体内可诱导其产生IL12抗体，可以减少小鼠体内动脉粥样硬化病损形成[2]。脂多糖(lipopolysacchride, LPS)是牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis，P. gingivalis)细胞壁的重要成分，能激活宿主的先天免疫系统，与牙周炎的发生和发展有密切的关系。LPS在进入血液后，在脂质聚集部位可以同细胞表面结构TLR2和TLR4以及与糖基化磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinosito，GPI)结合的CD14相结合，从而诱发炎症反应[3]。 P.gingivalis的活菌、外膜泡及其LPS在氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，oxLDL)存在时均能诱导单核/巨噬细胞形成泡沫细胞，并且在激活的巨噬细胞中影响脂质代谢[4]。本实验目的在于了解IL12在P.gingivalis LPS促进泡沫细胞形成过程中对细胞因子的影响，进一步了解牙周致病物质在促进动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)发生发展中的发病机理。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 人单核细胞株THP1(ATCC，中国科学院上海生命科学研究院传代分装);胎牛血清(北京Hyclone公司);PMA(美国Sigma公司);oxLDL(协和医科大学生化教研室脂蛋白组，北京协和三友科技有限公司);肿瘤坏死因子α(TNFα)和IL1β ELISA检测试剂盒(北京晶美生物公司);荧光定量 PCR 仪( PRISM 7700，美国Applied Biosystems公司);P.gingivalis LPS(美国Invivogen公司);IL12(美国PeproTech公司)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 THP1单核细胞的分化 人THP1细胞为悬浮细胞，以含100 mL/L胎牛血清的RMPI 1640培养基于37 ℃、50 mL/L的CO2培养箱中培养扩增。此后按不同的实验目的接种在6孔板内，以160 nmo1/L的PMA诱导36 h使其分化为巨噬细胞，然后使用无血清培养基培养24 h，以去除PMA对巨噬细胞的影响并且同步化细胞，再用于实验。

　　1.2.2 实验分组 为研究IL12在P.gingivalis LPS促进巨噬细胞吞噬oxLDL形成泡沫细胞过程中的影响，巨噬细胞按下面分组加入培养液：(1)空白对照组：以 RPMI 1640培养基培养;(2)oxLDL+LPS组：以RPMI 1640+50 μg/mL oxLDL+1 μg/mL P.gingivalis LPS共同培养;(3)IL12 2 h+oxLDL+LPS组：在RPMI 1640培养基中加入10 ng/mL IL12作用2 h后，再加入50 μg/mL oxLDL+1 μg/mL P.gingivalis LPS共同培养。

　　为研究IL12在P.gingivalis LPS对泡沫细胞的影响，巨噬细胞先以50 μg/mL oxLDL诱导48 h形成泡沫细胞，然后按下面培养条件进一步培养：(1)oxLDL 48 h+LPS组：泡沫细胞培养基中加入1 μg/mL P.gingivalis LPS;(2)oxLDL 48 h+IL12 2 h+LPS组：泡沫细胞中加入IL12作用2 h后，再加入1 μg/mL P.gingivalis LPS。

　　1.2.3 TNFα和IL1β水平的ELISA法检测 巨噬细胞培养液中加入各刺激物后48 h，吸出条件培养液，定容，以1 000 r/min离心5 min除去悬浮细胞，分装后置于-80 ℃冰箱保存。所用ELISA板采用双抗体夹心法，各取100 μL细胞条件培养液加入包被相应单抗的ELISA 96孔板中，按实验流程操作，终止反应后在450 nm处酶联免疫检测仪中测定吸光值。

　　1.2.4 IL1β、IL10、IL12 p40和IL18 mRNA表达的Realtime PCR检测 细胞以每孔2.5×106/2 mL接种于6孔板中，每个组接种3个复孔，将3孔细胞分别独立实验后收集在一起合为一个样本，即细胞总计每样本7.5×106，各组细胞加入LPS刺激后2 h，收集细胞，用Trizol试剂提取细胞总RNA，用1 μg/mL RNA合成cDNA。每组3次重复。根据Gene Bank公布的最新的人IL1β、IL10、IL12 p40、IL18基因及管家基因GAPDH的基因序列设计引物(表1)。

　　PCR反应条件为：95 ℃ ,4 min→ 59℃,20 s→72 ℃,20 s→GAPDH和IL12基因在82.5 ℃、IL18和IL10 在79 ℃、IL1β在81 ℃,20 s,共40个循环。为了建立PCR产物的熔解曲线，扩增反应结束后继续从72 ℃缓慢加热到99 ℃(8 min)建立PCR产物的熔解曲线。cDNA进入PCR指数增长期的起始点即循环阈值( cycle threshold，Ct)，依照标准曲线计算起始模板拷贝数，样本中IL1β、IL10、IL12 p40和IL18 mRNA的相对表达量定义为目的基因cDNA拷贝数与同一样品中GAPDH cDNA拷贝数的比值，以此比值作统计学分析。

　　1.3 统计学处理 数据用x±s表示，采用单因素方差分析(one way ANOVA)分析组间是否存在差别，如存在差别时采用LSD法进行两组之间的比较。P<0.05为差别有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 IL12预刺激对巨噬细胞和泡沫细胞培养上表1 Realtime PCR使用引物列表清液中IL1β和TNFα的影响 巨噬细胞和泡沫细胞受50 μg/mL oxLDL、1 μg/mL P.gingivalis LPS和/或10 ng/mL IL12刺激48 h后，细胞培养上清液中IL1β和TNFα的水平与空白对照组相比均明显升高(P<0.05)。IL12预刺激2 h可促进P.gingivalis LPS作用下泡沫细胞中IL1β的分泌，却减少了P.gingivalis LPS和oxLDL作用的巨噬细胞中TNFα的分泌(P<0.05，图1)。

　　n=3. A：空白对照组; B：oxLDL+ LPS组;C：IL12 2 h+oxLDL+LPS组;D：oxLDL 48 h+LPS组;E：oxLDL 48 h +IL12 2 h+ LPS组. 组间比较，△：P<0.05;与其他组比较，▲：P<0.05.

　　图1 IL12预刺激2 h对巨噬细胞和泡沫细胞吞噬P.gingivalis LPS和oxLDL过程中上清液中IL1β和TNFα的影响

　　Fig 1 Effects of IL12 preincubation on IL1β and TNFα level in the supernatants of P.gingivalis LPS and oxLDL treated macrophages and foam cells

　　2.2 IL12预刺激对巨噬细胞和泡沫细胞培养物中IL1β、IL10、IL12和IL18 mRNA的影响 加入各刺激物后，细胞内IL1β、IL10、IL12和IL18 mRNA转录水平明显高于空白对照组(P<0.05)，IL12预刺激2 h，一方面可抑制P.gingivalis LPS和oxLDL作用的巨噬细胞中IL10和IL12的转录水平;另一方面可促进P.gingivalis LPS作用下泡沫细胞中抗炎因子IL10的转录水平，抑制促炎因子IL18的转录水平。

　　A：空白对照组; B：oxLDL+LPS组;C：IL12 2h+oxLDL+LPS组;D：oxLDL48h+LPS组;E： oxLDL48h +IL12 2h+LPS组。组间比较，△：P<0.05;与其它组比较，▲：P<0.05.

　　图2 IL12预刺激2 h对巨噬细胞和泡沫细胞吞噬P.gingivalis LPS和oxLDL过程中IL1β、IL10、IL12和IL18 mRNA的影响(n=3)

　　Fig 2 Influence of IL12 preincubation on IL1β, IL10, IL12 and IL18 mRNA transcription in P.gingivalis LPS and oxLDL treated macrophages and foam cells (n=3)

　　3 讨 论

　　研究显示，牙周感染时，局部炎症或细菌及其产物可进入机体的循环系统，改变外周血中炎症介质的含量，进而对全身系统产生一定的影响，是某些系统性疾病的危险因素，牙周病与全身健康密切相关。牙周病作为慢性感染性疾病，其对动脉粥样硬化、缺血性心脏病、心肌梗死和脑血管意外具有潜在作用，牙周感染是心血管疾病的一个独立危险因素[5]。

　　P.gingivalis是牙周病的主要致病菌之一。研究发现，P.gingivalis感染会加快ApoE/小鼠AS的形成，感染动物的主动脉组织中可检测出P.gingivalis DNA[6]。采用血液灌注P.gingivalis LPS于ApoE-/-的小鼠会加速AS的进展[7]，因此认为P.gingivalis及其产物LPS等可能在牙周病致AS的发生发展过程中发挥重要作用[8]。AS是一种慢性炎症疾病，巨噬细胞被激活后分泌大量的促炎和抗炎的细胞因子，不仅影响其他细胞的生物学行为，而且也影响巨噬细胞本身[9]。IL12是单核/巨噬细胞分泌的一种重要的促炎细胞因子，可以作用于T细胞、NK细胞和巨噬细胞等多种类型细胞。Orange等在小鼠巨细胞病毒感染模型中使用低剂量的IL12(1 ng/d)发现，其具有增强NK的细胞毒作用及IFNγ的产生，并可显著减轻该病毒所致的肝炎[10]。Hauer等通过注射IL12于LDLr/的小鼠体内使其产生抗IL12的抗体，从而导致AS形成减少，因此IL12可能促进了AS的进展[2]。本实验使用IL12预刺激巨噬细胞和泡沫细胞2 h，再加入P.gingivali LPS和oxLDL，从而了解IL12预刺激对巨噬细胞和泡沫细胞细胞因子分泌的影响，探讨抗炎细胞因子与促炎细胞因子间的动态变化。

　　泡沫细胞是AS的主要细胞成分，它的形成是AS形成过程中一个标志性特征，因此泡沫细胞中促炎细胞因子和抗炎细胞因子间的平衡对泡沫细胞和动脉粥样斑块的转归具有重要作用。本结果提示IL12预作用可以降低巨噬细胞培养上清液中TNFα的水平，也可以抑制巨噬细胞中IL12的转录水平，增加了泡沫细胞吞噬LPS过程中培养物上清液中IL1β的水平，提高了泡沫细胞中抗炎细胞因子IL10的转录水平，降低了促炎细胞因子IL18的转录。因此认为，IL12作为一种促炎细胞因子，可以改变P.gingvialis LPS促泡沫细胞形成过程中的部分细胞因子的转录和分泌，促进巨噬细胞和泡沫细胞吞噬LPS过程中的抑制炎症的细胞因子如IL10的转录，从而使急性炎症转变为慢性炎症。研究结果中，IL12对泡沫细胞吞噬LPS过程中IL1β的基因转录水平和蛋白分泌水平并不相同，这可能与实验选择的时间点有关，在进一步的实验中如能选取更多的时间点，将可能更清楚地了解IL1β在基因和蛋白水平的动态变化过程。此外，由于基因在转录后翻译至蛋白质过程中受复杂的转录后调控[11]，这些因素也会影响上清液中蛋白水平的表达。

　　本研究主要探讨IL12预刺激对巨噬细胞和泡沫细胞吞噬P.gingivalis LPS和oxLDL过程中抗炎和促炎细胞因子表达的影响，结果发现IL12预刺激可以减弱巨噬细胞和泡沫细胞急性期促炎细胞因子的分泌，促进抗炎细胞因子的分泌。IL12预刺激对巨噬细胞吞噬脂质形成泡沫细胞过程中脂质代谢、细胞形态学和细胞毒性等的影响仍需进一步研究。

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