LYVE1表达对舌癌淋巴结转移影响的研究
发表时间：2011-12-08 浏览次数：467次
作者：郅克谦,高岭,赵璐,石明娟,任文豪,温玉 作者单位：1. 西安交通大学医学院附属口腔医院口腔颌面外科，陕西西安 710004;2. 西安医学院，陕西西安 710021;3. 四川大学华西口腔医院口腔颌面外科，四川成都
【摘要】目的 探讨淋巴管生成因子在舌癌中的变化规律以及与转移的相关性，为此类疾病的预防、治疗和判断预后提供理论依据。方法 选择舌癌病理石蜡切片 36例，对其中18例淋巴活检(LNB)阳性患者和18例淋巴活检阴性患者的肿瘤厚度和溃疡进行淋巴管内皮透明质烷受体1(LYVE1)和S100双重免疫染色，检测瘤内、瘤周和瘤间LYVE1的表达，并进行淋巴管计数及比较。结果 所有病例中均检测到淋巴管存在，肿瘤内管腔为活跃的淋巴管生成;外部主要是管壁清晰的成熟管腔。含有肿瘤细胞的淋巴系统以发育完成的管腔形式存在于肿瘤外部，淋巴活检阳性和阴性患者在淋巴计数方面无显著统计学差异。溃疡性舌癌瘤周淋巴计数较非溃疡性高，但不随厚度变化。结论 舌癌组织中肿瘤淋巴管生成与肿瘤浸润、淋巴结转移有关，LYVE1染色能较为可靠的显示淋巴管的分布。
【关键词】 舌癌;淋巴管生成;淋巴管;LYVE1;双重免疫染色
淋巴结转移是舌癌患者最重要的预后指标之一。舌癌主要通过淋巴道转移，由于缺少淋巴管特异性标志物，因此对肿瘤淋巴道转移方面的研究和了解较少[1]。最近有关淋巴管内皮透明质烷受体1(LYVE1)的发现，为肿瘤的淋巴道转移的研究提供了有利的工具。透明质烷是细胞外基质葡萄糖胺聚糖[2]，在所有脊椎动物的体液和基质中表达。通过双免疫荧光染色对LYVE1和血管内皮标志物CD34表达的研究，发现LYVE1与淋巴管表面的透明质烷结合，而在血管中完全缺失[3]。
1 资料与方法
1.1 病例选择
选择1998～2004年期间西安交通大学医学院附属口腔医院颌面外科36例原发性舌癌患者，18例淋巴结活检阳性，18例淋巴结活检阴性。这些患者在最初通过HE染色进行的组织学检测均无淋巴入侵迹象的报道。根据瘤体厚度和溃疡出现情况两种类型各自的预后价值进行匹配，对原始组织进行连续切片，并进行HE染色和S100和LYVE1相结合的双重染色。
1.2 试剂与方法
主要试剂：兔抗人淋巴管内皮透明质酸受体1(LYVE1)抗体(北京博奥森生物技术有限公司)。其他免疫组织化学试剂也购自北京博奥森生物技术有限公司。
方法：石蜡包埋肿瘤组织，4μm厚连续切片，聚L赖氨酸涂层载玻片37℃干燥过夜，所有切片常规HE染色，应用抗多克隆抗S100蛋白和淋巴管内皮细胞抗体进行双重标记的免疫细胞化学检测。组织切片经二甲苯脱蜡4min，经不同浓度酒精浸泡后自来水冲洗。载玻片在37℃、pH 7.0、含0.1g胰蛋白酶、0.01mol/L氯化钙的100mL蒸馏水中胰蛋白酶作用10min，应用Envision双重标记体系进行双重标记。经胰蛋白酶消化作用后自来水冲洗10min，过氧化物培养5min。所有载玻片用水冲洗后转至三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水(TBS)。应用稀释至1∶2000的一抗，切片放置于潮湿孵化箱内孵化30min，然后TBS冲洗，带有聚合抗体的辣根过氧化物酶的二抗作用30min，再用TBS冲洗载玻片，最后加入液体DAB作用10min形成最后反应产物。
初步染色完成后，对切片第二抗原进行修复，将其放入500mL 0.01mol/L的柠檬酸钠溶液中(pH 6.0)，700W微波修复10min，自来水冲洗后，应用双重染色液作用3min，然后TBS冲洗。在潮湿的孵化箱内对组织切片应用LYVE1 30min，再用TBS冲洗载玻片，加入粘附于碱性磷酸酶上的二级抗体30min，TBS冲洗，用底物染色处理切片15min形成最终反应产物，TBS冲洗，苏木素复染30s，脱水、透明、中性树胶封片。
1.3 使用Chalkley点计数法进行淋巴管评价
应用Chalkley点计数法对免疫细胞化学性双重染色的淋巴管进行评价。在低能状态下就能将S100/LYVE1染色切片扫描出来，确定其淋巴热点，该热点被界定为LYVE1阳性染色的淋巴管的集中点，使用固定于目镜上的Chalkley点阵显微镜计数法，在×40倍的情况下可以检测到个别热点，根据目镜上点的数目结合LYVE1染色的淋巴管上皮，给每个热点打分，每张切片平均分数的计算主要依据三个最高热点分数。
对每张舌癌切片的肿瘤边缘和肿瘤区采用淋巴增殖Chalkley计数法，该过程由2人采用盲法进行，对每个热点取平均值。“瘤周”为×40倍下肿瘤边缘的微观区域。“瘤性”为瘤内的肿瘤团块，包括间质和陷入瘤内的非肿瘤组织，瘤性淋巴计数包括瘤内和由于挤压或产生于肿瘤结节内的瘤外淋巴管。分别计数瘤周淋巴管和肿瘤性淋巴管，此外肿瘤内部淋巴系统需要单独计数，并与位于瘤周和瘤间淋巴系统结合起来比较。除了Chalkley分数以外，还要记录淋巴管内出现的肿瘤细胞。
1.4 统计学分析
应用SPSS 13.0统计软件包进行统计学处理。对各组连续性资料用秩和检验和H检验法进行比较，使用配对符号秩和检验进行配对资料的组间比较，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 在舌癌瘤周和瘤内区域LYVE1阳性淋巴管的观察
对HE和免疫细胞化学双重标记染色的LYVE1/S100舌癌进行评价，在所有舌癌切片中都可以见到淋巴管，不均匀性分布，呈袋状淋巴管集合，称为热结节。在瘤周和瘤间发现有界限清楚的上皮细胞和不含血细胞的囊腔，相反，肿瘤内淋巴系统含有一种纤维组织，囊腔界限不清，除了淋巴管染色外，LYVE1也能够在真皮层内对单个细胞进行染色。
2.2 瘤周淋巴管计数(PTLC)和肿瘤性淋巴管计数(TLC)的比较
通常认为肿瘤性淋巴系统是来自肿瘤内部，包括肿瘤内间质组织和内陷组织，瘤周区域在×40倍镜下观察肿瘤边缘的显微视野，将其分为肿瘤边缘内、外两部分，在肿瘤周围和肿瘤区域内比较淋巴管数量。
在18例淋巴活检阳性组内，PTLC平均值4.3，波动范围为0.2～8.0，TLC平均值3.7，波动范围2.2～7.8。在18例淋巴活检阴性组内，PTLC平均值4.6，波动范围0.7～7.1，TLC平均值4.0，波动范围0.0～5.9。淋巴活检阳性和阴性患者其PTLC和TLC二者之间比较，P>0.05，差异无统计学意义。根据原发性肿瘤中溃疡出现与否将患者分为2组：13例溃疡性舌癌平均TPC值为4.6;23例非溃疡肿瘤TLC平均值3.8，二者之间P>0.05，差异无统计学意义。而PTLC在溃疡性舌癌平均值5.4，非溃疡性舌癌平均值4.3，P<0.05，差异有统计学意义。
为研究淋巴管数量是否与肿瘤组织厚薄有关，将患者分为2组，为<2mm和≥2mm，结果显示患者肿瘤的厚薄与淋巴管数量差异无统计学意义。
2.3 瘤间淋巴管(IPTLC)和瘤内淋巴管(ITLC)的比较
产生于肿瘤结节内的淋巴系统与瘤间和瘤周淋巴结相比，在淋巴扩散中可能会起重要作用。因为肿瘤内淋巴系统显示一种界限不清的壁层，这一表象指出肿瘤自身正在进行淋巴管生成，因此，我们分别对ITTC和IPTLC进行比较。结果显示淋巴活检阳性患者，IPTLC和ITLC相比差异性显著增加，在淋巴活检阴性患者中也存在相似关系。然而，淋巴活检阳性和淋巴活检阴性患者间的IPTLC或ITLC差异无统计学意义。
此外，溃疡性和非溃疡性舌癌中淋巴数量进行比较，ITLC没有显著性差异，但IPTLC有显著性差异，溃疡性舌癌分数较高。而且，IPTLC或ITLC与肿瘤厚薄无显著性差异。
3 讨 论
选择性淋巴结清扫术的应用提高了舌癌患者的治愈率[4]，该手术方式目前被认为是舌癌患者最重要的预后因素。与术后并发症有关，包括外伤感染、淋巴管性水肿和神经损伤，对分期舌癌患者进行较少的侵入性治疗可能会避免这些问题，LYVE1作为一种淋巴管系统特殊标记物的发现将为预测疾病的结果提供一种可能的非侵入性方法。
SAHNI等[5]研究指出LYVE1染色可使我们看到淋巴管内的恶性黑色素瘤细胞，而在常规HE染色中看不到。由于所研究数量较少，虽然结果有显著性，但实际淋巴活检阳性患者组织学上显示淋巴浸润迹象不明显。因此，LYVE1和S100双重免疫染色的标记物也不能代表患者淋巴结，但通过使用更加特殊的舌癌标记物如MART1而非S100的进一步研究，将避免因细胞学解释而出现的一些相关问题。
LYVE1也能够提供一些肿瘤淋巴管生成的信息，DADRAS等[6]在阳性与阴性淋巴转移的患者中发现淋巴管的密度有显著不同，指出瘤周淋巴管密度可以用作黑色素瘤患者淋巴结转移的预后指标。本实验对淋巴管生成是否能够代替淋巴活检进行了深入的研究，从而避免该过程中相关问题，然而当我们研究周围性肿瘤、肿瘤性、肿瘤内淋巴系统时，在淋巴计数方面并没有表达出显著性差异。
溃疡的形成在舌癌分期中作为另一个独立的预后指标，能够明显的影响淋巴管生成[7]。本实验对瘤周、瘤间与瘤内区域比较其最高淋巴计数的三个热结节，发现在溃疡性和非溃疡性舌癌中存在显著性差异，基于体外舌癌细胞株的研究和将舌癌细胞株的异种器官移植到裸鼠中的体外研究[8]，认为血管内皮生长因子C(VEGFC)在肿瘤淋巴管生成中起重要作用[9]。相反，在研究人类舌癌时发现VEGFC仅有较低水平和异质性表达，并没有发现其表达水平与原发性肿瘤转移间存在相关性，在人类头颈部转移性鳞癌也发现类似观点。可能是因为VEGFC在人类舌癌中并不是主要淋巴管生成因子，或许存在一些其他更重要尚未发现的淋巴因子，从本研究的结果中可以假设，在舌癌中无论是什么驱动了淋巴管生成过程，都可能与这些肿瘤溃疡形成过程有关。
对于肿瘤内淋巴系统的来源始终存在不同见解[10]。但在本研究中，发现在淋巴活检阳性和阴性组内，肿瘤内淋巴计数没有显著性差异，相反，显示ITLC的数量稍高于淋巴结阳性组。在瘤周和瘤内区域发现的淋巴管显示为一种成熟的形态，并且囊腔界限清楚，说明可能是已经发育完成的管腔，并不是肿瘤血管生成的结果。
总之，由于舌部丰富的淋巴循环，导致舌癌较高的淋巴转移率，若能在术前准确判断淋巴转移情况，将在很大程度上提高舌癌患者的治愈率和有效生存率。由于本研究患者相对较少，淋巴计数在淋巴结引流方面还不能预测微转移性疾病，显示淋巴计数在预测舌癌淋巴转移潜能方面并不是特别有效，因此也不能替代淋巴活检。然而，对于溃疡却有显著性差异，通过观察溃疡性肿瘤，可以得出淋巴管生成可能与具有较高风险的转移性疾病有关，而LYVE1对淋巴管生成的研究具有相关价值性。LYVE1和S100双重免疫染色技术显示淋巴结阳性患者淋巴系统内肿瘤细胞出现的比例较高，然而，仍然缺乏显著性，因为大部分淋巴结阳性患者没有显示出这一特点。同时对舌癌中淋巴系统的研究指出肿瘤细胞是通过侵入形成的淋巴管从而进入区域性淋巴结的，而对淋巴管生成的分子机制及淋巴道转移的关系还需要进一步更深入的研究。
【参考文献】
[1]FRANCHI A, GALLO O, MASSI D, et al. Tumor lymphangiogenesis in head and neck squamous cell carcinoma. A morphometric study with clinical correlations [J]. Cancer, 2004,101(5):973978.
[2]王艳，朱波，陈正堂，等. LYVE1在肿瘤淋巴管生成领域的研究 [J]. 生命的化学, 2005, 25(4):314315.
[3]PREVO R, BANERJI S, FERGUSON DJP, et al. Mouse LYVE1 is an endocytic receptor for hyaluronan in lymphatic endothelium [J]. J Biol Chem, 2001, 276(22):1942019430.
[4]MORTON DL, WEN DR, WONG JH, et al. Technical details of intraoperative lymphatic mapping for early stage melanoma [J]. Arch Surg, 1992,127(4):392399.
[5]SAHNI D, ROBSON A, ORCHARD G, et al. The use of LYVE1 antibody for detecting lymphatic involvement in patients with malignant melanoma of known sentinel node status [J]. J Clin Pathol, 2005, 58(7):715721.
[6]DADRAS SS, PAUL T, BERTONCINI J, et al. Tumor lymphangiogenesis A novel prognostic indicator for cutaneous melanoma metastasis and survival [J]. Am J Pathol, 2003, 162(6):19511960.
[7]BALCH CM, BUZAID AC, SOONG SJ, et al. Final version of the American Joint Committee on Cancer staging system for cutaneous melanoma [J]. J Clin Oncol, 2001, 19(16):36353648.
[8]BEASLEY NJP, PREVO R, BANERJI S, et al. Intratumoral lymphangiogenesis and lymph node metastasis in head and neck cancer [J]. Cancer Res, 2002, 62(5):13151320.
[9]任为正，叶鸿飞，毕玉顺. 肿瘤淋巴管生成与肿瘤的淋巴道转移 [J]. 中国肿瘤生物治疗杂志, 2007, 14(6):596600.
[10]王俊，郭燕，陈正堂，等. 淋巴管生成与肿瘤转移 [J]. 中国肿瘤生物治疗杂志, 2006, 13(5):387389.
