骨形态发生蛋白/Smad信号转导机制及其对离心力刺激的响应

　　作者：程宗生综述,关键审校　　作者单位：佳木斯大学附属第二医院口腔颌面外科 黑龙江 佳木斯 154004

　　【摘要】骨形态发生蛋白(BMP)是一类转化生长因子-β超家族成员的多功能分泌型信号分子，参与调节多种细胞的增殖、分化和程序性死亡，在组织器官的形成、胚胎的发育和损伤组织的修复中起关键作用。Smad蛋白是BMP细胞内信号转导和调节分子，可以直接将BMP细胞外信号从细胞膜转导入细胞核，构成BMP/Smad信号转导通路，而BMP/Smad信号转导通路在调节牵张成骨新骨形成中发挥着重要作用。笔者下面就体外培养细胞离心力加载装置和BMP/Smad信号转导机制及其对离心力刺激的响应作一综述。

　　【关键词】 骨形态发生蛋白; Smad; 信号转导通路; 离心力刺激; 力传导

　　AMechanism of bone morphogenetic protein/Smad singaling pathway and its response to centrifugal force CHENG Zong-sheng, GUAN Jian. (Dept. of Oral and Maxillofacial Surgery, The Second Affiliated Hospital of Jiamusi University, Jiamusi 154004, China)

　　[Abstract] Bone morphogenetic protein(BMP), one of multifunctional secreted signaling molecules, is a member of the transforming growth factor-β superfamily. BMP regulates a wide spectrum of cellular functions such as pro-liferation, differentiation, migration and apoptosis, and also plays central roles in morphogenesis of various organs,embryonic development as well as reparation of injured tissues. Smad(sma-mad) protein is intracellular signaling transduction and regulatory molecules of BMP. Signal transduction studies have revealed that Smad can transduce the BMP signal from the cellmembrane to the nucleus, forming the BMP/Smad singaling pathway. Recently, researches have show that BMP/Smad singaling pathway regulates bone formation in distraction osteogenesis(DO). Indepth understanding of osteoblast BMP/Smad signaling pathway to stimulate the mechanical response mechanisms and the role of molecular biology DO mechanism for the application of exogenous BMP and provide a theoretical basis for gene therapy.

　　[Key words] bone morphogenetic protein; sma-mad; singaling pathway; centrifugal force; mechanotransduction

　　牵张成骨术(distraction osteogenesis，DO)过长时间的牵张和固定是限制其临床应用的主要原因。DO的分子生物学机制复杂，在细胞水平上，机械刺激可影响成骨细胞的生理活性，如细胞的增殖、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)活性和骨钙蛋白(osteocalcin，OC)合成等。成骨细胞将机械力学刺激转化为细胞的生化响应过程是DO的分子学理论基础。利用力学装置加载应力于体外培养的成骨细胞，模拟在体内DO时的力学环境，观察成骨细胞的生物学效应和力学信号转导机制是目前研究的热点之一。

　　1 力学刺激装置及其加力大小和时间

　　目前，系统研究成骨细胞对力学刺激信号的转导和响应主要建立于体外特定力学传导装置下细胞培养的基础上[1]。力学刺激装置通常分为离心力系统、压应力系统、张应力系统和流体剪切应力培养系统。离心力培养系统不仅可用于对成骨细胞间断的力学刺激，而且有较好的可操作性。

　　1.1 体外培养细胞的离心力加载装置

　　早期Beckerle等将体外分离得到的细胞定量计数后，悬浮于一定质量浓度的培养液中，再将装有细胞悬液的容器移至离心机上低速离心，悬浮的细胞受到离心力、重力以及细胞与基质相对移动所产生的摩擦力的综合作用。其缺点是细胞悬浮于基质中，细胞和细胞之间、细胞和基质之间未发生附着，其间存在着信号交流，故早期的悬浮细胞离心力加载不能真实反映其生理状态。

　　目前，体外培养细胞离心力加载多是将处于指数生长期的细胞接种到细胞培养板上，待接种细胞贴壁后继续培养24～48 h，消除消化液和接种对细胞的影响，使细胞充分贴附伸展，状态良好，对外界刺激反映迅捷。加载前的细胞用质量分数1%或无胎牛血清的培养基培养12～24 h，使其尽可能多的细胞处于同一生长周期，以减少试验的不确定因素。离心力加载时将以密封胶封闭的细胞培养板固定于特制的能与相应离心机匹配的细胞培养板支架上。

　　1.2 体外培养细胞加载离心力的大小和时间

　　Fitzgerald等[2]发现，对小鼠胚成骨细胞MC3T3-E1施加3 g的离心力相当于散步等轻微力量，施加287 g的离心力则相当于剧烈刺激的力量，贴壁细胞受到一个顶—底轴方向的压力。他们用抑制剂处理贴壁生长的MC3T3-E1，60 min后用离心机加载287 g的离心力5 min，再用二氧化碳孵箱培养30 min后提取总其RNA检测其目的基因，结果加载287 g离心力5 min能大量诱导成骨细胞即刻基因的表达。Lee等[3]将MC3T3-E1细胞离心机加载离心力10 min，再用二氧化碳孵箱培养7 h，如此重复1～9 d不等后施加间断离心力刺激。他们认为，间断施以40～400 g离心力为生理范围的刺激，其中100 g间断离心力加载3 d组刺激成骨细胞增殖和分化，增强AKP的活性和促进DNA的合成的效应明显高于其他试验组。

　　Hatton等[4]在对MC3T3-E1细胞离心加载时发现，4～30 g的离心力相当于40～300 με的应变，且短期的离心力加载15 min能使即刻基因的表达增加15倍。Li等[5]分别对成骨样细胞加载209、253和301 g的离心力10 min后，核心结合因子(core binding factor，Cbf)-α1、胶原Ⅰ和骨钙蛋白均增加且3种力值间无明显差异。此外，郑翼等[6]将MC3T3-E1细胞用LXJ-Ⅱ型离心沉淀机加载225 g离心力10 min，有效地刺激了成骨细胞的增殖和分化。总之，适宜的机械刺激可刺激细胞的增殖，影响其AKP活性，改变成骨细胞的特异性蛋白表达。

　　2 BMP/Smad信号转导机制及其对离心力刺激的响应

　　成骨细胞膜上的骨形态发生蛋白(bone mor-phogenetic protein，BMP)受体与机械刺激产生的BMP结合激发BMP信号转导，通过其细胞内底物Smad(sma-mad)进入核内与转录因子Cbf-α1、成骨细胞特异性转录因子(Osterix，Osx)和特异性核基质结合蛋白(special AT-rich binding protein，SATB)-2等相互作用影响特异性基因的表达，提高AKP、OC等的mRNA的转录，从而刺激骨形成以响应离心力的刺激。

　　2.1 BMP

　　BMP是一种存在于骨基质中的糖蛋白多肽，含有二硫键结构，相对分子质量为(1.8～3.0)×104，是转化生长因子-β超家族中最大的蛋白家族。BMP有20多位家族成员，除BMP-1外构成了一个结构和功能均相似的多肽因子家族。尤其是BMP-2、4、5、7能有效地促进骨髓基质干细胞向成骨细胞分化，诱导骨的形成，而且可抑制骨髓基质干细胞向脂肪细胞分化[7-9]，BMP-2因其诱导成骨活性最强而研究最多，重组人骨形成蛋白-2促进兔下颌牵张成骨的研究证实其具有成骨诱导活性[10]。Yates等[11]利用Yucatan小型猪下颌骨牵张成骨模型和反转录聚合酶链反应检测到，在牵张期和固定期均有bmp-2、4基因的表达。Campisi等[12]在兔下颌骨牵张成骨模型中发现，机械张力可增强bmp-2、4基因的表达，BMP-2、4蛋白很可能在牵张成骨过程中起核心作用。Rachmiel等[13-14]应用BMP-2外源性注射和腺病毒介导的bmp-2基因对试验动物DO后进行治疗，促进了其新骨沉积，缩短了固定期和提高了新骨质量。

　　2.2 BMP受体

　　BMP受体(bone morphogenetic protein recep-tor，BMPR)有BMPR-ⅠA、BMPR-ⅠB和BMPR-Ⅱ等3类，均属丝氨酸/苏氨酸激酶型受体。BMP与靶细胞膜上的BMPR-Ⅰ和BMPR-Ⅱ结合，BMPR-Ⅱ是结构活性型受体，通过和配体结合发生自身磷酸化而被激活，而自身活化的BMPR-Ⅱ磷酸化BMPR-Ⅰ高度保守的GS区的丝氨酸/苏氨酸残基从而激活BMPR-Ⅰ，至此完成BMPR的激活，受体复合物形成;所以，BMPR-Ⅰ和BMPR-Ⅱ受体均为BMP信号转导所必需。BMP可与BMP-2Ⅱ、活化素Ⅱ型受体(activin receptor-Ⅱ，ActR-Ⅱ)和活化素ⅡB型受体(ActR-ⅡB)3种不同的Ⅱ型受体结合，后两者还可与活化素家族成员结合并介导活化素信号转导[15]。

　　2.3 BMP/Smad信号转导通路

　　成骨细胞膜上的BMPR与机械刺激产生的BMP结合激活BMP信号转导，活化的BMPR-Ⅰ作用于细胞质内下游Smad。在目前的生物界中，一共有8个Smad家族成员。其中，Smad1、2、3、5、8为受体调节的Smad(receptor-regulated-Smad，R-Smad)，Smad4为共同的偶配体Smad(common-partner-Smad，Co-Smad)，Smad6、7为抑制性Smad(inhibitory-Smad，Ⅰ-Smad)。BMPR-Ⅰ使Smad1、5 、8末端丝氨酸残基(SSXSmotif)磷酸化，随后2个或1个R-Smad与1个Smad4以异源三聚体或异源二聚体R-Smad-Co-Smad的形式进入核内，作用于成骨细胞特异性转录因子Cbf-α1、Osx等的基因序列上上调其表达，从而增强成骨细胞AKP和OC的表达。BMPR-Ⅰ也可直接作用于AKP、OC的mRNA，使其表达量增加，从而促进成骨细胞的分化和成熟。

　　Cbf-α1是与Smad蛋白形成复合体的最重要的核转录因子。BMP阻滞剂的应用证实，Cbf-α1依赖的成骨细胞分化需要BMP的信号转导，Cbf-α1增强成骨细胞对BMP的应答[16]。Ryoo等[17-19]发现，BMP-2/Smad可上调远端较小基因(distal-less，dlx)-5、下调同源异形盒(muscle segmenthomeobox gene，msx)-2基因家族的表达，通过dlx-5和msx-2单独直接作用于AKP和OC的mRNA，或者通过与Cbf-α1和Osx的协同作用来促进成骨细胞的分化与成熟。头蛋白、chordin、gremlin、ventroptin和卵泡抑制蛋白(follistatin)等BMP细胞外阻遏蛋白和伪受体可通过与BMP形成无活性的复合物而抑制BMP配体与其特异性受体的结合，从而负向调控BMP信号转导。头蛋白为细胞外可扩散蛋白，呈质量浓度依赖性地抑制BMP的效应，即10、100和600 μg/L的头蛋白抑制BMP效应依次显著增强[20]。gremlin是一种能拮抗BMP-2、4、7的糖蛋白，可抑制BMP-2诱导Smad1、5、8的磷酸化作用[21]。

　　3 结语

　　各种信号途径通过通路间的“串话(crosstalk)”将信号整合为一种对靶基因转录调节总的效应。成骨细胞BMP/Smad信号转导通路对力学刺激响应的机制还不甚清楚，单一的BMP/Smad信号转导通路能否响应力学刺激，BMP/Smad信号转导通路在各种应答途径形成的复杂的网络中响应力学刺激的作用和意义有多大等问题，还需要进一步的研究，以便为外源性BMP的应用及其基因治疗提供理论基础。

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