带蒂皮瓣新生血管化机制中相关生长因子的作用

　　作者：张富贵,李权综述,唐休发审校　　作者单位：四川大学华西口腔医院头颈肿瘤外科 四川 成都 610041

　 【摘要】带蒂皮瓣新生血管化主要有血小管发生和血管生成两种机制，其中血管生成包括内皮出芽、套叠式血管生成和血管重建术。血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和血小板衍生生长因子在带蒂皮瓣新生血管化机制中具有重要作用，主要涉及临时基质形成、内皮细胞活化、内皮细胞增殖、周细胞和血管平滑肌细胞募集以及毛细血管网络形成。

　　【关键词】 带蒂皮瓣; 新生血管化; 血小管发生; 血管生成; 生长因子

　　AFunction of related growth factors in the neovascularizational mechanism of pedicle flaps ZHANG Fu-gui,LI Quan, TANG Xiu-fa. (Dept. of Head and Neck Tumor Surgery, West China College of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, China)

　　[Abstract] Two mechanisms, vasculogenesis and angiogenesis, can elucidate the neovascularization of pedicle flaps, in which angiogenesis contains endothelial sprouting, intussusceptive angiogenesis and revascularization. Some critical growth actors, such as vascular endothelial growth factor, basic fibroblast growth factor, platelet-derived growth factor, play important roles in the neovascularizational mechanism of pedicle flaps. The roles mainly involve formation of matrix, activation of endothelial cell, proliferation of endothelial cell, recruitment of pericyte and vascular smooth muscle cell, and formation of capillary network.

　　[Key words] pedicle flap; neovascularization; vasculogenesis; angiogenesis; growth factor

　　带蒂皮瓣常用于组织缺损修复或美容重建[1]。皮瓣大小取决其血供情况，其长宽间服从于对数曲线规律，否则会因血供不足而坏死[2]。远端皮瓣坏死是带蒂皮瓣移植最常见的并发症[3]。如何减少皮瓣坏死，提高带蒂皮瓣的成活力已有不少研究，如基因治疗法、外科延迟法、皮瓣预制法、超声法和药物疗法[3-8]等。不少学者对基因疗法中的血管内皮生长因子(vascular endothelialgrowth factor，VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)和血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)等促进带蒂皮瓣成活机制进行了深入研究，旨在为进一步探讨带蒂皮瓣新生血管化机制提供理论依据。

　　1 带蒂皮瓣新生血管化

　　带蒂皮瓣的成活能力受皮瓣新生血管化程度的影响，而皮瓣新生血管化主要有血小管发生和血管生成。因此，研究新生血管化的策略有治疗性血小管发生和治疗性血管生成[9]。血小管发生系指胚胎期募集未分化的内皮原细胞endothelial progenitor cell，EPC)的原位增殖、分化，重新组装形成原始血管网的过程。血管生成系指分化成熟的血管内皮细胞(endothelial cell，EC)在原始毛细血管网基础上的重塑与扩展[10]。传统的观点认为，血管生成是成人新生血管化的唯一方式;但近年来的研究发现，血小管发生也参与成人新生血管化[11]。

　　治疗性血小管发生是利用循环细胞，如骨髓来源的单核细胞分化为EPC并促进血管生长[12]。但是，注射EPC于循环系统后第14天且需要大量的EPC才能明显地改善带蒂皮瓣新生血管化，而大量的EPC并不容易获得[13]。骨髓源性EPC治疗性血小管发生的数目在新生血管化过程中仅占皮瓣内新生血管的20%左右，因此治疗性血小管发生只是带蒂皮瓣新生血管化的一种替代方法[14]。治疗性血管生成系指利用纤维蛋白、腺病毒或腺相关病毒等生长因子介导的vegf-A cDNA重组载体的基因治疗。这些生长因子既可提高体外试验细胞的生存能力和分化程度，也可直接关系到体内血管形成，成为一种治疗缺血皮瓣的有效方案[1，3，15]。vegf基因转染EPC后，EPC均能大量地表达VEGF且后者在第4天就能达到高峰。vegf基因转染EPC较非转染EPC具有更强的增殖能力，更能促进带蒂皮瓣的新生血管化[9]。

　　2 带蒂皮瓣新生血管化过程

　　2.1 带蒂皮瓣血小管发生过程

　　带蒂皮瓣血小管发生过程涉及EPC的产生、增殖和分化，EPC迁移到血管末梢或穿过基底膜在基质内聚集，EPC延长成条索状结构，条索状结构交织成毛细管网络，毛细管网络发生内皮化和管腔化[10]。在生长因子、细胞因子、激素、适度低氧低血状态刺激下，骨髓、脐带血和外周血来源的EPC能通过局部趋化、增殖分化成各种血液循环相关细胞，并在生理和病理新生血管化中起到持续性的血管形成作用[12，16]。Hur等[16]发现，EPC早期主要通过生成促进定居的成熟的EC募集、增殖和生成血管源性细胞因子来增加新生血管化，后期因为其高度增殖能力为新生血管化提供足量的EC而促进血小管发生。Lu等[17]发现，脂肪源性干细胞能直接促进EC的产生，并通过产生各种生长因子间接促进EC形成血管，证实了Hur等[16]的观点。值得注意的是，血小管发生最初形成的血管虽然缺乏血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)、周细胞及其他相关细胞，但是初生的内皮管道仍能保持相当长的一段时间[10]。

　　2.2 带蒂皮瓣血管生成过程

　　血管生成包括内皮出芽、套叠式血管生成(intussusceptive angiogenesis，IA)和血管重建术。经典的血管生成即内皮出芽：首先在VEGF和一氧化氮(nitrogen，NO)作用下，血管渗透性增加，血浆渗出形成临时基质;EC活化和增殖;基质金属蛋白酶(matrix metalloprotease，MMP)溶解基底膜，EC穿破基底膜迁移进入细胞间隙，EC再增殖;接着募集周细胞与VSMC;细胞之间和细胞与基质之间粘连，基底膜重建，连接复合体成熟，最终形成完整的毛细血管[9]。IA：在大静脉及其分支，首先是两侧相对的EC向管腔内突出，细胞膜发生接触并在其接触边缘处形成内皮间连接;继而接触面的细胞膜变薄，再由细胞质产生的压力将其打开并分割成两个基本环;最后由成纤维细胞和周细胞组成的间充质细胞形成柱状或杆状的组织结构，填充两个新生血管环之间的缺口。新形成的基本血管环不断地延长、增殖、重塑并与原先存在血管连接，不断地完善血管网络[18]。血管重建术系指在皮瓣血管不断向中心退化的同时，由分化成熟的受区血管EC从创基与创周沿着皮瓣原先的血管网基底膜向皮瓣内增殖、生长覆盖皮瓣原有的血管，并与从对侧长入的EC或未退化的EC相吻合形成完整管腔的程序性过程[19]。

　　3 生长因子在带蒂皮瓣新生血管化中的调节作用

　　3.1 血管扩张与细胞外临时基质的产生

　　VEGF与受体结合后能促进早期血管扩张。VEGF主要受体VEGFR-1(或Flt-1)和VEGFR-2(或Flk-1或KDR)是与新生血管化有关的高亲和力酪氨酸激酶受体(tyrosine kinase with immunoglo-bulin-like loops and epidermal growth factor ho-mology domain，Tie)[16]。VEGF-165能有力地促进皮瓣血管扩张，其机制为：VEGF-165与Flk-1结合后激活磷脂酶C(phospholipase，PLC)-蛋白激酶C(protein kinase，PKC);再激活原生型NO合酶，致使内皮型NO合酶蛋白表达上调;刺激VEGF-165介导的NO体积分数增加，皮瓣血管扩张，增加皮瓣早期血供，提高成活能力[20-21]。NO触发VEGF-165介导血管扩张的效应机制为：非水溶性NO直接跨细胞膜进入细胞质，结合受体鸟苷酸环化酶，与锰离子一道将鸟苷三磷酸转化为环鸟苷酸，后者促进细胞内钙离子外流，降低收缩强度。故带蒂皮瓣内若只注射VEGF或左型精氨酸，虽可减少皮瓣坏死，却增加坏死区域的收缩程度。将VEGF与NO共同注射能引起血管扩张，诱发血管生成，提高其成活能力，而不会增加坏死区域收缩程度[22]。另外，VEGF可产生血管基底膜分解所需要的MMP。血管舒张使血管通透性增加，血浆蛋白渗出形成临时基质;同时，MMP与血纤维蛋白溶酶原激活剂增加，降解阻碍血管EC迁移的细胞外基质(extracellular matrix，ECM)[23]。

　　3.2 EPC和EC的活化

　　bFGF和VEGF在创伤愈合过程中具有协同作用：在血管再生早期，由bFGF诱导EPC和EC活化;后期，EC的增殖与分化由VEGF调节。张从纪等[24]利用酶联免疫吸附测定检测改进的家兔颌面部爆炸伤动物模型中bFGF和VECF的含量，结果bFGF的含量在伤后6 h达到峰值，之后迅速下降;而VEGF的含量在伤后第1周内稳步上升，于伤后7 d才达峰值。这说明bFGF刺激血管再生的启动，而VEGF则调节和维持之后的血管再生过程。bFGF主要通过核转录因子(nuclear factor，NF)-κB途径发挥其功能：当信号从膜受体复合体转移到NF-κB诱导激酶与NF-кB抑制蛋白(inhibitor-κ-binding，I-κB)激酶复合体时，I-κB被磷酸化后与NF-κB解离而失去其抑制作用，NF-κB被活化。NF-κB是DNA转录启动的核因子[25]，能促进EC和EPC的活化、迁移与增殖。组织细胞迁移与增殖是组织修复、皮瓣愈合和血管形成的基础[26-27]。FGF-2较VEGF-121或VEGF-165植入附近有更多血管新生且其管径亦大于后两者，即FGF-2更能促进带蒂皮瓣成活，为利用bFGF进行基因治疗和预防带蒂皮瓣缺血坏死提供了理论依据[28]。

　　3.3 EPC和EC的增殖

　　VEGF能特异地促进EC的有丝分裂、增殖与迁移，外源性地给予VEGF蛋白或cDNA或VEGF转染骨髓间充质干细胞，均可显著提高带蒂皮瓣的成活面积和生存力[1，3，15，29]。Flk-1是新生血管化的直接和主要信号传感器，与其他酪氨酸激酶受体不同的是，Flk-1不是通过ras信号途径，而是通过PLC-PKC信号途径激活促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)-细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)。ERK是MAPK信号途径的核内转录因子，激活DNA增殖，即促进EC和EPC的增殖[30]。

　　3.4 周细胞和VSMC增殖及聚集与ECM产生

　　TGF-β通过募集VSMC和周细胞包绕新形成的血管并刺激其增殖，使血管系统功能逐渐成熟和完善。TGF-β通过MAPK信号途径发挥其功能：即依次激活ras、raf、MEK和ERK。在核内，ERK磷酸化p62三聚体复合因子，后者与p67血清反应因子结合形成活性转录复合体[31]。但Seay等[32]认为，TGF-β主要通过Smad信号途径发挥其功能：即信号从受体转移至SARA-Smad2复合体后，后者释放Smad2，Smad2与Smad4结合并转位至核内且在共转录激活因子的协助下启动DNA转录。通过阻断TGF-β受体1或P38MAPK途径，TGF-β的生长促进作用会受到抑制。另外，TGF-β还能促进ECM合成。Lee等[33]发现，机械法或化学法去除角膜上皮能增加TGF-β的表达，TGF-β表达的增加能加重角膜浑浊;反之减少TGF-β，能减轻角膜浑浊。

　　3.5 血管管腔形成和成熟及稳定性维持

　　成熟毛细血管网络形成，即血管管腔形成和成熟及稳定性维持。VEGF还可通过NF-κB途径发挥其功能，即VEGF(Flt-1和Flk-1)可通过多种信号途径提高带蒂皮瓣的成活能力[25]。Flt-1信号途径可能在EC间和EC与ECM间连接，即在管腔形成过程中发挥主要作用。基底膜主要由Ⅳ型胶原、层粘连蛋白和整联蛋白-β1和αv组成。Ⅳ型胶原是合成基底膜的主要胶原，层粘连蛋白是内皮基底膜非胶原型ECM的主要成分，整联蛋白-β1和αv是ECM的主要受体并能调节血管生成过程中细胞与ECM间的相互连接。EC通过缝隙连接和紧密连接保持血管的完整性，前者由血管内皮钙黏蛋白、血小板内皮粘连分子和结合蛋白组成。阻断小鼠血管内皮钙黏蛋白后，EC处于分散状态不能形成血管[34]。

　　Tie-2和血管生成素(angiogenin，Ang)信号途径在血管生成过程中能显著促进内皮出芽。Tie-2与Ang-1和Ang-2结合后磷酸化，再与磷脂酰肌醇3激酶调节亚基P85作用激活Akb，上调生存素，增加细胞存活;与此同时，磷脂酰肌醇3激酶可激活局部黏附激酶刺激细胞迁移。Tie-2的其他两个亚基Grb和Shp亦能促进细胞迁移，并且在其残基Y1106上的停靠蛋白磷酸化后与Nck能协同增加周细胞和VSMC的聚集，增强EC间连接，有利于维持血管壁完整，促进血管成熟和重塑[35]。此外，PDGF通过NF-κB 信号途径趋化间充质细胞进入正在发育的血管壁，使后者增殖分化为VSMC;同时促使成纤维细胞合成纤维素，促进血管的成熟[18]。PDGF与VEGF在提高带蒂皮瓣成活能力方面具有同等的效力，因此pdgf基因治疗可成为治疗缺血带蒂皮瓣的一种新策略[36]。

　　4 结束语

　　带蒂皮瓣新生血管化是一个多因素、多步骤的程序性过程：不同生长因子作用于血管形成的不同阶段;不同生长因子可通过相同的信号途径协同提高带蒂皮瓣的成活能力[1]，一种生长因子可通过一种或多种信号途径提高带蒂皮瓣的成活能力;NF-κB信号途径可能会成为今后缺血皮瓣治疗的靶途径[23]。然而，将病毒载体整合入宿主基因的副反应和长期安全性始终是人们一直关注的焦点，并且还需进一步证实这些理论。

　　【参考文献】

　　[1] Huang N, Khan A, Ashrafpour H, et al. Am J PhysiolHeart Circ Physiol, 2006, 291(1)：H127-H137.

　　[2] 彭继跃, 王翰章. 华西口腔医学杂志, 1992, 10(2)：74-77.

　　[3] Antonini A, Zacchigna S, Papa G, et al. Microsurgery, 2007, 27(5)：439-445.

　　[4] Ozkan O, Coskunfirat OK, Ozgentas HE, et al. Plast Reconstr Surg, 2005, 116(7)：1945-1952.

　　[5] Gurunluoglu R, Meirer R, Shafighi M, et al. Microsurgery, 2005, 25(5)：433-441.

　　[6] Huemer GM, Meirer R, Gurunluoglu R, et al. Wound Re-pair Regen, 2005, 13(3)：262-268.

　　[7] Tufan H, Zaki BM, Tecder-Unal M, et al. Ann Plast Surg, 2007, 58(4)：441-448.

　　[8] Lineaweaver WC, Lei MP, Mustain W, et al. Ann Surg, 2004, 239(6)：866-875.

　　[9] Yi C, Xia W, Zheng Y, et al. J Surg Res, 2006, 135(1)：100-106.

　　[10] Cox CM, Poole TJ. Dev Dyn, 2000, 218(2)：371-382.

　　[11] Asahara T, Masuda H, Takahashi T, et al. Circ Res, 1999, 85(3)：221-228.

　　[12] Shintani S, Murohara T, Ikeda H, et al. Circulation, 2001, 103(6)：897-903.

　　[13] Park S, Tepper OM, Galiano RD, et al. Plast Reconstr Surg, 2004, 113(1)：284-293.

　　[14] Capla JM, Ceradini DJ, Tepper OM, et al. Plast Reconstr Surg, 2006, 117(3)：836-844.

　　[15] Michlits W, Mittermayr R, Sch?覿fer R, et al. Wound Re-pair Regen, 2007, 15(3)：360-367.

　　[16] Hur J, Yoon CH, Kim HS, et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2004, 24(2)：288-293.

　　[17] Lu F, Mizuno H, Uysal CA, et al. Plast Reconstr Surg, 2008, 121(1)：50-58.

　　[18] Patan S, Munn LL, Tanda S, et al. Circ Res, 2001, 89(8)：723-731.

　　[19] Rothenfluh DA, Demhartner TJ, Fraitzl CR, et al. ActaOrthop Scand, 2004, 75(3)：359-365.

　　[20] Khan A, Ashrafpour H, Huang N, et al. Am J PhysiolRegul Integr Comp Physiol, 2004, 287(5)：R1219-R1229.

　　[21] Furuta S, Vadiveloo P, Romeo-Meeuw R, et al. Angiogenesis, 2004, 7(1)：33-43.

　　[22] Komorowska-Timek E, Timek TA, Brevetti LS, et al. Br J Plast Surg, 2004, 57(4)：317-325.

　　[23] Bergers G, Brekken R, McMahon G, et al. Nat Cell Biol, 2000, 2(10)：737-744.

　　[24] 张从纪, 李慧增, 周树夏, 等. 华西口腔医学杂志, 2001, 19(2)：77-80.

　　[25] Wang XT, Liu PY, Tang JB. Plast Reconstr Surg, 2006, 117(1)：129-139.

　　[26] Tang JB, Xu Y, Wang XT. Plast Reconstr Surg, 2004, 113(6)：1703-1711.

　　[27] Tang JB, Xu Y, Ding F, et al. J Hand Surg[Am], 2003, 28(2)：215-220.

　　[28] Rinsch C, Quinodoz P, Pittet B, et al. Gene Ther, 2001, 8(7)：523-533.

　　[29] Zheng Y, Yi C, Xia W, et al. Plast Reconstr Surg , 2008, 121(1)：59-69.

　　[30] Takahashi T, Ueno H, Shibuya M. Oncogene, 1999, 18(13)：2221-2230.

　　[31] Douillet CD, Velarde V, Christopher JT, et al. Am JPhysiol Heart Circ Physiol, 2000, 279(6)：H2829-H2837.

　　[32] Seay U, Sedding D, Krick S, et al. J Pharmacol Exp Ther, 2005, 315(3)：1005-1012.

　　[33] Lee JJ, Kim MK, Shin KS, et al. J Cataract Refract Surg, 2008, 34(4)：662-669.

　　[34] Sakurai A, Fukuhara S, Yamagishi A, et al. Mol Biol Cell, 2006, 17(2)：966-976.

　　[35] DeBusk LM, Hallahan DE, Lin PC. Exp Cell Res, 2004, 298(1)：167-177.

　　[36] Liu PY, Wang XT, Badiavas E, et al. J Reconstr Microsurg, 2005, 21(4)：273-279.