人唇腺和腮腺CCL28表达比较

　　作者：刘雪 姜淑敏 唐伟 姚丽霞 王更如 姜广水 作者单位：(山东大学口腔医学院 口腔生物医学实验室，山东 济南 250012;山东省荣军医院 口腔科，山东 济南 250013;山东大学医学院 医学微生物学教研室，山东 济南 250012)

　　【摘要】 目的 比较人小涎腺与大涎腺CCL28的表达差异，以期探讨CCL28在小涎腺IgA分泌中的作用。方法 应用实时荧光定量PCR技术，分别检测13例健康成人唇腺和8例健康成人腮腺标本中CCL28 mRNA表达的相对量;然后用SPSS 10.0统计软件对数据进行秩和检验。结果 CCL28 mRNA在人的唇腺中有丰富的表达，并且唇腺中的CCL28 mRNA的表达量高于腮腺(P<0.01)。结论 唇腺中CCL28表达量显著高于腮腺，说明小涎腺分泌高浓度IgA可能与CCL28高表达有关。

　　【关键词】 唇腺，腮腺，实时荧光定量PCR

　　Comparison of CCL28 in human labial glands and parotids

　　LIU Xue, JIANG Shu-min, TANG Wei, YAO Li-xia, WANG Geng-ru, JIANG Guang-shui.

　　(Oral Biological Laboratory, School of Stomatology, Shandong University, Jinan 250012, China; Dept. of Stomatology, Provincial Veteran Hospital of Shandong, Jinan 250013, China; Dept. of Microbiology, School of Medicine, Shandong University, Jinan 250012, China)

　　[Abstract] Objective To compare the expression of CCL28 in minor and major salivary glands and clarify the role it plays in IgA secreting by minor salivary glands in oral cavity. Methods Labial gland and parotid samples were analyzed with real-time fluorescent quantitative PCR assay for CCL28 mRNA. Rank-sum test was used for data analysis using SPSS 10.0 software package. Results CCL28 mRNA was abundantly expressed in labial glands of healthy adults. Its expression was higher than that in parotids(P<0.01). Conclusion The resuits of this article sug-gest that the expression level of CCL28 in labial glands is remarkably higher than that in parotids, which reminds us that the high concentration of IgA in minor salivary glands may be associated with their high expression of CCL28.

　　[Key words] labial gland; parotid; real-time fluorescent quantitative PCR

　　口腔中的IgA是口腔免疫防御机制中至关重要的因素之一，主要来自涎腺，其中来自小涎腺的占30%~35%[1]。CCL28是近来发现的一种趋化性细胞因子，属于该家族的CC类[2]。CCL28通过与受体CCR10结合[3]，介导血循环中的IgA+抗体分泌细胞，归巢迁徙至相关组织[4]。有研究者通过斑点杂交证实，多种组织的上皮细胞高表达CCL28[5]，其中包括大涎腺[6-7]。然而人小涎腺中CCL28的表达及分泌情况迄今尚未见报道。

　　本研究采用实时荧光定量PCR技术检测唇腺中CCL28 mRNA的表达，并在此基础上对唇腺和腮腺中CCL28的表达情况进行比较。

　　1 材料和方法

　　1.1 仪器设备

　　Prism 7000型实时荧光定量PCR仪(ABI公司，美国)，Biofuge stratos 低温离心机(德国贺利氏公司)，DL-CJ-IN型高性能超净工作台(哈尔滨市东联电子技术开发有限公司)，Biosciences genequant分光光度计(美国安玛西亚公司)，T gradient PCR仪(Whatman Biometra公司，德国)，GDS-8000凝胶成像系统(UVP公司，美国)，Powerpac basic水平电泳仪(Bio-RAD公司，美国)，DHG-9241型电热恒温干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)，ULTRA Low超低温冰箱、Labo Autoclave高压灭菌器(Sanyo公司，日本)。

　　1.2 试剂

　　焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate，DEPC)，总RNA提取试剂盒(TaKaRa公司，日本)，反转录试剂盒(晶美生物工程有限公司)，PCR试剂盒(TaKaRa公司，日本)，实时荧光定量PCR(SYBR GreenⅠ法)试剂盒(TaKaRa公司，日本)，DNA Marker DL2000(TaKaRa公司，日本)，琼脂糖(上海生工生物工程技术服务有限公司)，光学96孔板及光学贴膜(ABI公司，美国)。

　　1.3 引物的设计与合成

　　根据GeneBank中人CCL28及β-actin的基因序列设计引物，并委托TaKaRa公司合成，其序列分别如下。CCL28上游引物：5′-CAGAGAGGACTCGCCA- TCGT-3′，CCL28下游引物：5′-TGTGAAACCTC-CGTGCAACA-3′，β-actin上游引物：5′-GACTAC-CTCATGAAGATCCTCACC-3′，β-actin下游引物：5′-TCTCCTTAATGTCACGCACGATT-3′，目的片段CCL28和β-actin的长度分别为101 bp和85 bp。

　　1.4 标本

　　13例唇腺标本均来自山东大学口腔医学院的健康志愿者，8例腮腺标本由山东大学齐鲁医院口腔颌面外科姚丽霞惠赠，9例大肠标本由山东大学齐鲁医院吴剑波惠赠。

　　1.5 方法

　　1.5.1 收集标本 2%利多卡因黏膜下浸润麻醉后，在距左侧口角1 cm，距前庭沟底1~2 cm处作长约1 cm的纵行切口。切开黏膜层，在黏膜层下钝性分离，显露并摘取3~4枚腺泡。标本离体后迅速放入液氮中冷冻，并转入超低温冰箱保存备用。

　　1.5.2 提取总RNA 将大小合适(100 mg左右)的组织块在液氮中研碎，Trizol法提取其中的总RNA。RNA沉淀溶于适量的DEPC水后用分光光度计测其浓度及光密度值。

　　1.5.3 反转录及普通PCR 反转录按照试剂盒说明书完成。反转录时应用Random引物。PCR的目的是验证cDNA的质量。PCR按照说明书进行，反应条件为94 ℃ 3 min;94 ℃ 30s;58 ℃ 30 s;72 ℃ 40 s;72 ℃ 5 min;4 ℃ 1 h。循环数为33个。以2%的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定。

　　1.5.4 实时荧光定量PCR 以β-actin为内参照，采用SYBR GreenⅠ染料法对唇腺及腮腺中的CCL28进行相对定量。反应条件为：95 ℃ 10 s;95 ℃ 5 s;60 ℃ 31 s。循环数为40个。为保证结果的可靠，每个样本作3个重复。

　　1.6 统计学分析

　　CCL28的表达量用x±s表示，采用统计软件SPSS 10.0对数据进行统计分析，采用秩和检验比较组间CCL28表达量的差异，P<0.05表示差异具有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 总RNA的获得及反转录PCR结果

　　A260 nm/A280 nm在1.8~2.0之间的RNA纯度合格，可以用于反转录。反转录后以cDNA为模板进行PCR扩增。从产物的电泳图(图1)可以看出，反应获得了预期的CCL28和β-actin的片段，因此该cDNA可以用于实时荧光定量PCR。

　　2.2 实时荧光定量PCR结果

　　扩增反应顺利完成，反应结束后制作的融解曲线显示无非特异性扩增产物。CCL28的相对定量结果见图2。其中有2份唇腺标本因加样出现问题而被舍去。CCL28在唇腺中的表达量为170.67±77.55，在大肠中为19.50±14.55(图3)。唇腺和腮腺CCL28的表达量分别为1.28±0.57和0.79±0.24。即唇腺CCL28的表达量显著高于腮腺，差异具有显著性(P<0.01，图4)。

　　3 讨论

　　分泌型IgA是唾液中主要的抗体成分，是防御口腔内大多数病原体的第一道防线[8]。其功能包括：防止微生物通过凝集作用聚集到黏膜表面，阻断受体介导的黏附，改变黏膜表面的疏水性[9]。另有证据[10]表明抗原的排除、毒素的中和、侵袭性酶的抑制等也是分泌型IgA的重要功能。

　　Lazarus等[4]证明CCL28可以选择性趋化吸引IgA+ ASC。其作用机制可能是，相关组织毛细血管微静脉内皮细胞表面上的由局部组织产生的CCL28通过与循环中的IgA+抗体分泌细胞表面表达的CCR10结合，使IgA+抗体分泌细胞大量表达相应整联蛋白。整联蛋白与相应黏附分子牢固结合，启动IgA+抗体分泌细胞的跨血管运动机制，并最终以阿米巴运动穿过内皮间隙，顺着涎腺组织内CCL28的浓度梯度到达涎腺实体组织内，并在此处产生IgA;之后IgA被转运到唾液中。

　　已有对腮腺、结肠、直肠中CCL28表达情况的研究[5]发现，在这些组织中以腮腺中表达CCL28最为丰富。但对于小涎腺中的CCL28表达情况尚无人研究。本研究应用实时荧光定量PCR技术达到了以下目的：首先，以大肠组织作为对照，证实了唇腺中表达CCL28 mRNA，且其表达量显著高于大肠;其次，比较了唇腺和腮腺中CCL28的表达量，发现其在唇腺中的表达比腮腺更丰富。另外，早先已有学者证实唇腺所分泌的唾液中IgA的浓度比腮腺高4倍[1，11]。据此可以得出结论，小涎腺分泌高浓度IgA可能与其高表达CCL28有关。

　　【参考文献】

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