人涎腺腺样囊性癌相关同源异型盒基因差异表达的研究

　　作者：夏辉 李龙江 韩波 潘剑 高宁 作者单位：口腔疾病研究国家重点实验室，四川大学，四川 成都 610041

　　【摘要】 目的 研究人涎腺腺样囊性癌及正常腺体中同源异型盒基因的表达差异，认识该基因与涎腺腺样囊性癌发生发展的关系。方法 设立6组严格配对的腺样囊性癌/癌旁腺体标本及2组腺样囊性癌细胞株/癌旁腺体标本，采用定制的含232条人类同源异型盒基因探针的Oligo芯片进行分析，归纳2组间差异基因信息。荧光实时定量PCR技术检测高度可疑的涎腺腺样囊性癌相关基因在不同样本中的mRNA表达水平，统计学分析找出明显异常表达的同源异型盒基因。结果 组织样本出现上调的同源异型盒基因67条，下调基因54条;细胞样本中出现上调的同源异型盒基因12条，下调基因15条;同时出现在组织及细胞样本中的上调基因1条(TGIF);下调基因7条，出现频数较高的为EVX1、PITX1。荧光实时定量PCR检测显示TGIF、EVX1在ACC-M与正常腺体组织的表达量有统计学差异。结论 同源异型盒基因作为细胞正常增殖和分化的关键基因，可能与涎腺腺样囊性癌形成过程密切相关。

　　【关键词】 腺样囊性癌，同源异型盒基因， 基因芯片

　　Research on the differently expressed Homeobox genes related to adenoid cystic carcinoma XIA Hui, LI Long-jiang, HAN Bo, PAN Jian, GAO Ning. (State Key Laboratory of Oral Diseases, Sichuan University, Chengdu 610041, China)

　　[Abstract] Objective To investigate the differently expressed Homeobox genes between adenoid cystic carcinoma of salivary gland and normal gland tissue, and find out the effect of Homeobox genes on oncogenesis and differentiation of adenoid cystic carcinoma of salivary gland. Methods Six strictly paired specimens including adenoid cystic carcinoma and its surrounding normal gland tissue and two pairs of specimens including cell strain of adenoid cystic carcinoma and its surrounding normal gland tissue were established. Customized Oligo microarray which contains probes of 232 human Homeobox genes was used to analyze and conclude two groups of different genes data. RT-PCR technique was used to examine the mRNA expressing level of highly suspected relevant genes of adenoid cystic carcinoma in different specimens. Obvious differently expressed Homeobox genes were found through statistical analyses. Results In tissue specimens Homeobox genes were found 67 up-regulated and 54 down-regulated, and in cell specimens Homeobox genes were found 12 up-regulated and 15 down-regulated. One up-regulated gene and 7 down-regulated genes were found both in tissue and cell specimens, among which EVX1 and PITX1 were the most frequent. RT-PCR showed that there was statistical expressing difference between TGIF, EVX1 and normal gland tissue in ACC-M. Conclusion As the key gene to cellular proliferation and differentiation, Homeobox genes are closely relevant to the oncogenesis of adenoid cystic carcinoma of salivary gland.

　　[Key words] adenoid cystic carcinoma; Homeobox gene; gene microarray

　　同源异型盒基因作为细胞正常增殖和分化的关键基因，掌控着细胞的发展方向，与细胞恶性转化及恶性增殖密切相关。寻找和确定在涎腺腺样囊性癌发病中起作用的关键同源异型盒基因，将对涎腺腺样囊性癌发病机制的研究探索及其临床治疗提供一个新的契机。本研究通过定制表达谱芯片和荧光实时定量PCR技术，对人涎腺腺样囊性癌及正常腺体标本进行基因表达差异的定性和定量研究，探索差异表达的同源异型盒基因在涎腺腺样囊性癌发生、发展及去分化过程中的变化规律。

　　1 材料和方法

　　1.1 病例及样本采集

　　四川大学华西口腔医院头颈肿瘤病房涎腺腺样囊性癌住院患者6例，男性4例，女性2例，年龄32~71岁，平均年龄48.2岁。其中3例位于右颌下腺，2例位于左腭，1例位于左舌下腺。依UICC(2002年)[1]TNM分期，T2期2例，T3期3例，T4期1例。所有患者均经活检确诊，且术前未接受任何治疗。原发灶切除后，于病灶中心区切取5 mm×5 mm×5 mm组织块，剔去多余组织;同时于病灶外2 cm处切取同样大小的正常腺体组织。DEPC液清洗血迹，无菌纱布轻拭水迹。将各标本均分为二，一份行10%甲醛溶液固定，石蜡切片，苏木精-伊红染色，病理学观察;另一份放入DEPC液预处理的冻存管内，并立即投入液氮中，以备RNA提取。样本采集过程于10 min

　　内在无菌下完成，以避免RNA降解和试验者RNase污染。人涎腺腺样囊性癌细胞系ACC-2(低转移株)及ACC-M(高转移株)由四川大学口腔疾病研究国家重点实验室保存，按常规方法复苏。

　　1.2 总RNA的抽提、纯化及质检

　　将组织块标本称重后，首先在液氮中研碎，然后在组织匀浆机上充分匀浆，移至15 mL RNase free离心管中离心，去上清液，加入预冷的总RNA提取液Trizol(Invitrogen公司，美国，每100 mg组织加入1 mL Trizol)。转入1.5 mL的新鲜EP管内，氯仿提取，异丙醇沉淀，沉淀溶解于生物级纯水中备用。为了更好地去除基因组DNA的污染，采用无RNase的DNA酶Ⅰ处理，从而提高样品纯度。应用分光光度仪检测总RNA的质量和浓度，采用Oligo-dT亲和纯化法纯化样品总RNA，1%琼脂凝胶电泳质检(正常电泳图谱有清晰的28 s、18 s和5 s条带)。RNA总量不足的标本进行平行的线性放大，以便进行后续检测。

　　1.3 定制同源异型盒基因表达谱芯片

　　利用美国国立生物技术信息中心网站上的人类基因组数据库，以Homeobox(同源异型盒)为检索词检索得到同源异型盒基因各成员，依相关生物学软件设计寡核苷酸芯片探针共232条。定制芯片使用进口Oligo基片，点样仪采用GeneMachine公司的OmniGrid 100，总共点制8张芯片。阳性点14个，阴性点1个，芯片内每个矩阵的第一列和第二列的前面7个点为质控点，各矩阵的质控点都相同;每个基因在同一芯片内重复4次试验。

　　1.4 芯片杂交

　　实验标记方法应用cDNA直接标记法，其中实验组RNA采用cy3荧光标记，对照组RNA采用荧光cy5标记。标记后利用等量的探针进行杂交。扫描杂交芯片，读取数据，计算ratio值(cy3/cy5比值)，判定结果。ratio值在0.5~2.0范围内的基因不存在表达差异，ratio≥2.0为上调基因，ratio≤0.5为下调基因。

　　1.5 逆转录成cDNA

　　提取组织中的总RNA后，以其中的mRNA作为模板，采用随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。实验采用MBI公司的Revert AidTM Frist Strand cDNA Synthesis Kit，在PCR仪上进行扩增。

　　1.6 设计引物

　　根据GeneBank上TGIF、EVX1及PITX1的mRNA序列CDS区，分别设计3对引物。为了避免基因组DNA的污染，上下游引物均设计为跨过内含子。引物间片段长分别为18、20、18 bp。另外选取人的18 s序列作为参照物，同样设计引物。

　　1.7 常规PCR扩增，荧光实时定量PCR检测TGIF、EVX1、PITX1和参照物18 s

　　采用琼脂糖凝胶电泳定性检测目的基因的扩增水平，荧光实时定量PCR检测TGIF、EVX1、PITX1和参照物18 s，测定每个样品管中荧光强度增加到某一特定阈值(threshold)时的扩增循环数(Ct值)，根据Ct值与标准模板初始拷贝的对数值作图，得到该样品的标准曲线。该实验重复3次进行。

　　1.8 数据处理和统计学分析

　　在测定TGIF、EVX1及PITX1基因的同时测定作为内参的内源性管家基因18 s，并以18 s为比较标准，折算出各样本起始模板数的相对数量关系。

　　具体方法采用Livak和Schmittgen根据数学推导得出的比较阈值法，公式如下：目的基因的相对量=2-△△Ct，△Ct=[Ct GI(待测样品)-Ct18 s(待测样品)]-[Ct GI(校正样品)-Ct18 s(校正样品)]。在该公式中，Ct是热循环仪检测到反应体系中荧光信号的强度值，GI是目的基因，校正样品是任何被选做代表1倍目的基因表达量的样品。所以，2-△△Ct表示的是实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数。采用统计学软件SPSS 12.0对每组的2-△△Ct进行单因素方差分析，如有差别采用LSD法进行多组间参数的两两比较。

　　2 结果

　　2.1 临床标本病理结果

　　标本组织学切片行苏木精-伊红染色，病理诊断证实为涎腺腺样囊性癌，癌旁组织为正常腺体组织。

　　2.2 RNA质检结果

　　本实验收集6组涎腺腺样囊性癌患者标本(腺样囊性癌组织，癌旁正常腺体组织)，2组涎腺腺样囊性癌细胞样本(ACC-2、ACC-M及正常腺体组织)，共计15个样本，分别将提取的总RNA进行1%琼脂糖凝胶电泳，可见清晰的28 s、18 s、5 s 3条区带(图1)，质检合格。

　　2.3 定制芯片杂交、扫描及信号分析

　　每张芯片中检测2个样本(实验组与对照组)，涎腺腺样囊性癌组织、细胞分别与正常腺体组织样本作对照。芯片杂交前扫描图像及各组试验杂交后扫描图像见图2图2定制芯片杂交、扫描及信号结果。绿色代表低表达基因，红色代表高表达基因，黄色为无差异表达。可见芯片信号强度高，片内信号均一，同一样品2张芯片2个重复点相关系数均高于80%，同一芯片内部质控阳性点信号的差异系数大于0.33的不超过30%，各项指标均达到标准，实验成功。

　　2.4 共同差异基因的筛选

　　本研究共检测6组组织样本和2组细胞样本，将8张杂交芯片的数据文件导入EXCEL软件，以升序排列ratio值，分别筛选出芯片中试验组出现上、下调的Homeobox基因并存档。对照8张芯片的差异表达基因，统计各差异表达Homeobox基因在各组样本中出现的频度(frequence，F)，F值较高的共同差异表达基因见表1。

　　统计结果显示：出现上调的Homeobox基因67条，F值≥3的基因为9条，同时出现在组织及细胞样本中的上调基因1条(TGIF)。下调的eobox基因数量累计共54条，F值≥3的基因为10条。EVX1的频数较高且同时在组织及细胞样本中出现下调，PITX1的频数较高，但在细胞样本中无差异表达。

　　2.5 荧光实时定量PCR的结果

　　选取3条筛选出的基因(TGIF、EVX1和PITX1)进行荧光实时定量PCR检测，将实验所得目标基因和内参基因的Ct值用公式进行数据处理，2-ΔΔCt值就是各个样本间基因表达量的倍数关系。具体结果见表2。

　　将EVX1、PITX1及TGIF在NT(正常腺体组织)、ACC-2及ACC-M中的表达量进行单因素方差分析，EVX1的P值为0.001，PITX1的P值为0.000，TGIF的P值为0.029，均有统计学差异。将各组细胞样本与正常腺体样本进行两两比较，发现EVX1在ACC-M中的表达量显著低于正常腺体组织，两者均值相差约200倍;PITX1在ACC-2及ACC-M中的表达量与正常腺体组织相比均无统计学差异;TGIF在ACC-M中的表达量显著高于正常腺体组织，两者均值相差约8倍(图3)图3 TGIF、EVX1及PITX1的相对表达量。

　　3 讨论

　　同源异型盒基因是一类在进化上高度保守的DNA序列，最初作为同源异型突变中的果蝇座位而得名[2]。目前研究发现的同源异型盒基因家族成员有大约200个，存在酵母乃至人类几乎所有的真核细胞中，占脊椎动物整个基因组数量的0.2%[3]。同源异型盒基因均具有183个核苷酸长度的同源区，编码由61个氨基酸组成的同源蛋白域，即同源异型域(homeodomain，HD)[4]。该区域通常折叠成3个螺旋状结构，并通过第2、3螺旋间的螺旋-折角-螺旋模块与靶基因的DNA序列特异性锚定结合，进而实现对下游受控基因的激活或抑制作用[5]。同源异型盒基因通过编码一类特殊的转录调节因子对所在细胞的分化进行调节;并且还能通过调节控制信息传递相关分子和多种激素的合成来影响相邻细胞间及远距离的信息传递，从而调节胚胎的发育和成熟。研究[6]发现，同源异型盒基因在成人组织细胞的增殖、分化过程中也发挥着主控作用。同源异型盒基因发生突变，个体发育以及组织器官形成就可能出现异常，严重者还可以诱发细胞的恶性转化，最终形成肿瘤[7]。此外，还有学者发现同源异型盒基因可能在恶性肿瘤转移中起复杂的制衡作用[8]。

　　本研究利用定制表达谱芯片在6组人涎腺腺样囊性癌/癌旁正常腺体组织间发现差异表达基因共121条(上调基因67条，下调基因54条)，通过比较6组人涎腺腺样囊性癌组织和2组涎腺腺样囊性癌细胞样本的Homeobox基因表达谱，找出其中具有共性的异常表达基因，以搜索出可能与涎腺腺样囊性癌发生、分化相关的Homeobox基因。

　　在67条上调基因中，DLX5的表达频数最高，但在2组细胞样本中均无差异表达，而TGIF的表达频数虽然相对较低，但在组织样本及细胞样本中均出现了差异表达。由于细胞样本成分相对均一，能更好地反映肿瘤的细胞学特性，因此选用上调基因TGIF进行荧光实时定量PCR检测。在54条下调基因中，EVX1出现频数最高，在组织样本及细胞样本中均有差异表达，高度怀疑EVX1与涎腺腺样囊性癌的发生发展密切相关，因此进行了进一步的荧光实时定量PCR检测。PITX1在组织样本中出现频数较高，而在细胞样本中无差异表达。由于基因芯片的结果可能存在假阳性或假阴性的情况，因此对该基因进行了荧光实时定量PCR检测，通过定量的方法发现PITX1在细胞样本和组织样本中的表达无统计学差异，进一步验证了基因芯片结果的可靠性。

　　通过基因芯片筛选和荧光实时定量PCR技术的进一步验证，以下2条基因被认为是与涎腺腺样囊性癌高度相关的基因。1)TGIF：TGIF在高转移细胞株ACC-M中相对表达量显著升高，推测该基因可能与涎腺腺样囊性癌的转移能力相关。TGIF主要的功能为抑制转录作用，其突变会导致前脑及颅颜发育畸形。目前已证实TGIF是针对转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)和视黄醛信号传导通路的抑制分子，且MAPK通路的活化能延长其半衰期，是TGF-β信号传导通路的抑制分子，而TGF-β早期抑制肿瘤生长，晚期促进肿瘤浸润与转移。但TGIF在肿瘤发生中的作用尚不清楚。研究认为TGIF能抑制TGF-β1对细胞生长和细胞周期的负调控作用，多数肿瘤细胞和间质细胞能分泌TGF-β1，这些肿瘤细胞有可能利用TGIF，抑制TGF-β对自身的生长抑制作用，从而促进肿瘤的发生、发展与转移。胡忠良等[9]将TGIF反义寡核苷酸瞬时转染胃癌细胞株SGC-7901，并进行相关细胞学检测，结果发现SGC-7901细胞转染TGIF反义寡核苷酸后，细胞增生受到部分抑制，但细胞的凋亡和细胞周期分布无明显改变。TGF-β1处理后，TGIF反义寡核苷酸转染的SGC-7901细胞的增生受到明显抑制。还有研究[10]发现，TGIF通过抑制TGF-β和视黄醛可能促进食管癌的发生与发展。2)EVX1：基因芯片检测时EVX1在ACC-2、ACC-M中均表现为下调差异基因，在6组涎腺腺样囊性癌组织样本中有5组出现该基因的下调。荧光实时定量PCR显示EVX1在ACC-M中的表达量明显低于正常腺体组织，两者均值相差约200倍，具有统计学差异。EVX1在ACC-M和ACC-2中相对表达量的差异说明该基因可能对涎腺腺样囊性癌的发生、发展及诱导分化起重要的抑制作用。EVX1蛋白可能是胚胎形成时重要的转录抑制因子，但其在人类中的作用目前尚没有相关研究报道。

　　本实验通过定制表达谱芯片和荧光实时定量PCR技术，发现TGIF、EVX1在涎腺腺样囊性癌组织和正常涎腺组织中有明显差异表达，推测这2条基因可能在涎腺腺样囊性癌的发生、发展及诱导分化中起重要的作用。

　　【参考文献】

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　　10 Nakakuki K, Imoto I, Pimkhaokham A, et al. Novel targets forthe 18p11.3 amplification frequently observed in esophageal squa-mous cell carcinomas[J]. Carcinogenesis, 2002, 23(1)：19-24.