3种髓腔穿孔修复材料对人牙周膜成纤维细胞毒性的体外研究

　　作者：汪莉 尹仕海 钟素兰 揭有琼 作者单位：(口腔疾病研究国家重点实验室，四川大学，四川 成都 610041;双流县第一人民医院 口腔科，四川 成都 610200;四川大学华西口腔医院 牙体牙髓病科，四川 成都 610041)

　　【摘要】 目的 对三氧化矿物凝聚体(MTA)、Z350纳米复合树脂、银汞合金3种常用髓腔穿孔修复材料对人牙周膜成纤维细胞(HPDLF)毒性进行体外比较研究。方法 采用甲基噻唑基四唑(MTT)法研究3种材料对HPDLF增殖的影响，并采用荧光定量聚合酶链反应(PCR)法研究材料对细胞碱性磷酸酶(ALP)和骨钙素(OC)mRNA表达的影响。结果 MTA的毒性最小，并能上调HPDLF中ALP mRNA和OC mRNA的表达;Z350的毒性级为1级，能够促进细胞ALP mRNA的表达，对细胞OC mRNA的表达基本无抑制;银汞合金对细胞增殖的抑制作用最大，毒性级为3级，具有中度细胞毒性，对细胞ALP mRNA和OC mRNA表达的抑制最强。结论 MTA对HPDLF的毒性最小，并且能促进HPDLF的成骨功能和分化，Z350纳米复合树脂次之，银汞合金的毒性最大，并抑制牙周膜成纤维细胞的分化。

　　【关键词】 髓腔穿孔，穿孔修复材料，人牙周膜成纤维细胞，细胞毒性

　　Cytotoxicity evaluation of three kinds of perforation repair materials on human periodontal ligament fibroblasts in vitro

　　WANG Li, YIN Shi-hai, ZHONG Su-lan, JIE You-qiong.

　　(State Key Laboratory of Oral Diseases，Sichuan University, Chengdu 610041, China; Dept. of Stomatology, Shuangliu First People′s Hospital, Chengdu 610200, China; Dept. of Endodontics, West China College of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, China)

　　[Abstract] Objective To select three kinds of perforation repair materials, mineral trioxide aggregate(MTA), Z350, amalgam. And to evaluate the cytotoxicity of three kinds of perforation repair materials on human periodontal ligament fibroblasts(HPDLF) in vitro. Methods The proliferation of HPDLF to three perforation repair materialswere examined by methyl thiazolyl tetrazolium(MTT) assay at 1, 3 and 5 days. The mRNA expression levels of bone-associated alkaline phosphatase(ALP) and osteocalcin(OC) were determined using a real-time quantitative polymerase chain reaction(PCR). Results MTA shew almost no inhibition to HPDLF, the expression of ALP mRNA and OC mRNA in the HPDLF cultured on MTA were higher. Z350 induced a slight inhibition to HPDLF, and the expression of ALP mRNA but there was no difference in the expression of OC mRNA. Cell proliferation was signifi-cantly impaired by amalgam with grade 3, and the expression of ALP mRNA and OC mRNA were significantly reduced. Conclusion MTA have minimum cytotoxicity on HPDLF and can promote cell differentiation and regenerate of periodontal tissue. Z350 have lower cytotoxicity on HPDLF. Amalgam show highest cytotoxicity on HPDLF in the three materials and inhibit cells differentiation.

　　[Key words] perforation; perforation repair materials; human periodontal ligament fibroblast; cytotoxicity

　　髓腔穿孔是指髓室或根管与牙周组织非生理性的通道。其临床危害性极为严重，若不及时修复或修复方法不当，可显著影响治疗效果，最终可能导致患牙的拔除[1]。影响髓腔穿孔修复效果的因素，除了穿孔本身状况和修复方法外，修复材料的选择尤为重要。Sinai等[2]认为理想的髓腔穿孔修复材料，除了应严密封闭穿孔洞型外，还应具有良好的生物相容性，对牙周组织无刺激性和无毒性，能诱导骨或牙骨质形成，能促进牙周组织的修复再生等。

　　常用的髓腔穿孔修复材料有银汞合金[3]、复合树脂[4]、玻璃离子等。近年来的新型纳米树脂如FiltekTM Z350纳米复合树脂，虽然填料粒度小，出现微渗漏的现象较少，但是，这种纳米树脂是由树脂基质组成的，仍然会对周围组织产生一定的刺激。三氧化矿物凝聚体(mineral trioxide aggregate，MTA)是一种新型的生物修复材料，现在已广泛应用于牙髓病的治疗中。本研究通过甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)法研究MTA、Z350纳米复合树脂、银汞合金对细胞增殖的影响，并采用荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain re-action，PCR)法研究材料对细胞碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)和骨钙素(osteocalcin，OC)mRNA表达的影响来评价材料对细胞成骨性能及分化的影响，为临床筛选具有良好生物学性能的髓腔穿孔修复材料提供实验依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 实验分组及浸提液的制备

　　实验分为4组，A组为MTA组，B组为Z350组，C组为银汞合金组，D组为对照组(含20%小牛血清的DMEM培养基)。前3组为实验组，按照使用说明制备成直径为5.0 mm，高为2.5 mm的圆柱体，表面不经过打磨抛光程序，紫外线消毒30 min，将消毒后的材料浸入含20%小牛血清的DMEM培养基中，使标本的表面积与培养基的体积比为0.6 cm2·mL-1[5]。将实验组和对照组置于37 ℃、5%CO2、95%O2、100%湿度孵箱7 d后用于实验。

　　1.2 实验细胞

　　将四川大学口腔疾病研究国家重点实验室提供的人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligamentfibroblasts，HPDLF)传代至第6代备用。

　　1.3 方法

　　1.3.1 细胞增殖的测定 将第6代HPDLF用胰酶消化后以密度为每毫升2×104个接种于3块96孔板中，每孔200 μL，培养24 h，弃液。实验组每孔加入200 μL浸提液，每4孔为1组，对照组加培养基，隔天更换药物及培养基，培养1、3、5 d后各取1板，采用MTT法检测光密度值(A值)。按照公式计算细胞相对增殖率(relative growth rate，RGR)，RGR=A实验组 /A对照组×100%[6]。按RGR范围进行毒性分级：1)RGR≥100%，毒性级为0级;2)75%≤RGR≤99%，毒性级为1级;3)50%≤RGR≤74%，毒性级为2级;4)25%≤RGR≤49%，毒性级为3级;5)1%≤RGR≤24%，毒性级为4级;6)RGR=0%，毒性级为5级。毒性级越大，毒性越大。

　　1.3.2 实时荧光定量PCR检测ALP mRNA和OC mRNA的表达水平 将第6代HPDLF胰酶消化后以密度为每毫升1×105个接种于3块6孔板中，每孔2 mL，在含5%CO2、37 ℃下培养24 h，弃液。实验组每孔加入2 mL浸提液，每4孔1组，对照组加培养基, 隔天更换药物及培养基。培养5 d后，弃去培养液，提取细胞总RNA，并作琼脂糖凝胶电泳。将提取的总RNA逆转录合成cDNA，扩增目的基因，最后实时荧光定量PCR扩增目的基因。荧光定量RCR的反应体系共30 μL，包括：10×缓冲液3 μL，dNTP 0.36 μL(25 mmol·L-1)，MgCl2 3 μL，上游引物和下游引物各1 μL(10 μmol·L-1)，染料(10 μmol·L-1)1 μL，Taq聚合酶0.3 μL，ddH2O 15.34 μL，cDNA 5 μL。

　　反应条件：94 ℃预变性2 min;94 ℃ 20 s，54 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，45个循环，以双蒸水作阴性对照。选用管家基因GAPDH为内参基因，根据反应体系中荧光信号的强度值，即Ct值，记录实验组和对照组中目的基因和管家基因的Ct值，用目的基因的定量结果除以管家基因的定量结果，从而得到校正值。进一步将样本的基因表达除以对照组的基因表达，得到相对定量结果，表示的是实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数。采用Primer5.0引物设计软件，按照实时荧光定量PCR的要求设计引物，引物序列如下：GAPDH的上游引物为5′-CCTCAAGATCATCAGCAAT-3′，下游引物为5′-CCATCCACAGTCTTCTGGGT-3′，产物长度为141 bp;ALP上游引物为5′-CGCTGTGTCAACTCCACCT-3′，下游引物为5′-CCAGAAGGTTCTGTTAACTTG-3′，产物长度为148 bp;OC上游引物为5′-GTGCAGCCTTT- GTGTCCAAG-3′，下游引物为5′-GTCAGCCAACT- CGTCACAGT-3′，产物长度为130 bp。

　　1.4 统计学方法

　　应用SPSS 12.0统计软件对MTT法结果进行单因素方差分析;应用REST专业软件对荧光定量PCR结果的Ct值进行分析，P<0.05为显著性标准，即为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 3种材料对HPDLF增殖的影响

　　3种材料与HPDLF共同培养1、3、5 d后，材料浸提液对细胞的增殖都有一定的影响(表1)。银汞合金组毒性级均为3级，有中度细胞毒性，与Z350组、MTA组和对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。Z350组毒性级为1级，基本没有细胞毒性，与其他3组相比差异有统计学意义(P<0.05)。MTA组细胞增殖良好，与Z350组和银汞合金组相比差异有统计学意义(P<0.05)。培养1、3、5 d后，MTA组与对照组相比，差异均无统计学意义。

　　2.2 3种材料对细胞ALP mRNA和OC mRNA表达水平的影响

　　ALP和OC基因产物的扩增产物电泳结果在凝胶成像系统中进行观察，在148 bp处可见目的基因ALP mRNA条带，130 bp处可见目的基因OC mRNA条带，141 bp处可见GAPDH对照条带。

　　不同材料对细胞ALP mRNA及OC mRNA相对表达的影响见表2。实时荧光定量PCR结果表明：4组材料对细胞ALP mRNA的表达水平相比较，其差异有统计学意义(P<0.05)。对OC mRNA表达水平的影响, MTA组与Z350组、银汞合金组、对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05);Z350组与MTA组、银汞合金组相比差异有统计学意义(P<0.05)，与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05);银汞合金组与MTA组、Z350组、对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。MTA能上调HPDLF中ALP mRNA和OC mRNA的表达;Z350能够促进细胞ALP mRNA的表达，对细胞OC mRNA的表达基本无抑制;银汞合金对细胞ALP mRNA和OC mRNA表达的抑制作用最强。

　　3 讨论

　　髓腔穿孔修复后，修复材料的细胞毒性直接影响穿孔的预后。髓腔穿孔修复材料直接与牙周组织持续接触，一方面通过组织液长期对修复材料的浸提作用对牙周组织产生影响;另一方面材料直接刺激牙周组织，影响细胞附着、形态及增殖，影响牙槽骨的重建。因此，髓腔穿孔修复材料应具有良好的生物相容性，并且能促进牙周组织再生。由于临床修复髓腔穿孔时，材料直接接触穿孔处牙周膜组织，因而本实验选用原代培养的HPDLF作为细胞毒性实验的目标细胞，以能更接近口内实际情况。

　　银汞合金对组织的影响主要在于它的腐蚀可引起锡、铜、银及汞离子或汞蒸汽释放，这些腐蚀产物可在邻近组织内聚积，引起局部组织反应[7]。Z350通用修复材料是3M公司生产的一种新型的纳米树脂，该纳米团簇粒子的尺寸范围在0.6～1.4 μm，无机填充剂重量大约占65%(体积大约占55%)，由于填料粒度小, 可进入几个聚合链之间，可以不使用石英化填料，从而不产生凝聚成丛现象，因此出现微渗漏现象也少，对牙髓的刺激也小。但是，Z350也含有双酚A双甲基丙烯酸缩水甘油酯(bisphenol-A diglycidyl methacrylate，bis-GMA)、氨基甲酸酯双甲基丙烯酸酯(urethane dimethacrylate，UDMA)、双甲基丙烯酸二缩三乙二醇酯(triethylene glycol di-methacrylate，TEGDMA)树脂，单体向聚合物的转化率仍无法达到100%，残留单体和聚合产热仍会对充填体周围的组织产生一定刺激。MTA 作为一种新型的生物修复材料，自Lee等[8]报道以来，引起了国内外学者和临床医生的广泛兴趣，可以广泛应用于牙体牙髓病的治疗，如直接盖髓术、根尖成形术、根尖倒充填、根管侧壁和髓室底穿孔的修复或充填材料。电子探测微量分析的结果显示，MTA 的主要离子成分为钙、磷离子，与牙齿硬组织的离子成分相同。已有研究表明，MTA对人体组织具有良好的生物相容性[9]。但是，关于MTA对HPDLF骨质矿化相关基因的表达的研究较少。本研究主要目的是通过MTT法观察评价3种常用髓腔穿孔修复材料(MTA、Z350纳米复合树脂及银汞合金)对HPDLF增殖的影响，并采用荧光定量PCR法检测成骨活性标记物ALPmRNA和OC mRNA水平来评价材料对细胞成骨性能及分化的影响，为临床筛选具有良好生物学性能的髓腔穿孔修复材料提供实验依据。

　　MTT法[10]是观察细胞增殖最常用的实验室评价方法。本实验结果显示，MTA、Z350及银汞合金3种髓腔穿孔修复材料的浸提液对HPDLF的增殖均有一定的抑制作用。MTA组细胞增殖良好，毒性级为1级，即MTA对HPDLF的增殖无抑制。Z350的细胞毒性小于银汞合金而比MTA稍大。银汞合金组毒性最大，有中度细胞毒性，与Pistorius等[11]的研究结果一致。但是，有学者将银汞合金、MTA等材料放置24 h后取浸提72 h的浸提液与V79细胞相互作用24 h，观察发现银汞合金和MTA的细胞毒性相近。这与本实验研究结果差异较大，一方面可能是由于该实验将修复材料放置了24 h，银汞合金固化后释出的金属离子减少所致，另一方面可能是由于2个实验选用的实验细胞不同，从而导致实验结果不一致。

　　评价髓腔修复材料的生物相容性往往还应通过研究材料对细胞成骨相关基因表达的影响预测材料的体内成骨的影响[12]，ALP、OC等骨形成相关基因的表达物是检测的重点[13]，被看作是成纤维细胞向成骨样细胞转化的重要标志。本实验采用实时荧光定量PCR技术比较研究3种髓室底穿孔修补材料对HPDLF的ALP mRNA和OC mRNA表达的影响。实时荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光基团，通过对PCR反应进程中的荧光信号强度进行实时监测，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法，定量准确率高，重复性好[14]。本研究发现，MTA能上调HPDLF中ALP mRNA和OC mRNA的表达，促进细胞向成骨样细胞分化;而Z350能促进细胞ALP mRNA的表达，对细胞OC mRNA的表达抑制作用不大;银汞合金对细胞ALP mRNA和OC mRNA表达的抑制最强。Bonson等[15]体外检测MTA对牙周膜成纤维细胞的影响，结果表明细胞在与MTA接触培养后均能表达与骨修复及骨质再矿化相关的基因，尤其是能提高ALP的表达，与本实验的研究结果一致。

　　基于本研究结果建议，临床修复髓腔穿孔时，可以选择MTA一类细胞毒性小的修复材料，以有利于达到减少炎症反应、促进组织修复的目的。但在没有MTA广泛用于临床的情况下，纳米复合树脂也不失为修复髓腔穿孔的一种较好的选择，应尽量避免或减少银汞合金在髓腔穿孔修复中的使用。

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