人骨髓间充质干细胞对同种异体调节性T细胞的影响及可能机制实验研究

　　作者：杨靖,王庆海,曾秋棠,毛晓波　　作者单位：华中科技大学同济医学院附属协和医院心内科，武汉 430022

　　【摘要】 本研究探讨人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells, hMSC)对同种异体CD4+CD25+调节T细胞的作用，进一步查明人骨髓间充质干细胞对T淋巴细胞免疫调节作用的可能机制。从人骨髓中分离培养hMSC，通过免疫组织化学方法检测其表面标记并进行鉴定。从非亲缘供者健康人外周血中提取单个核细胞，在IL2作用下体外培养， 实验组加入不同数量级hMSC(1×103，1×104，1×105)共培养5天，对照组加入PBS。于结束培养前18小时经3HTdR标记后用β液体闪烁计数仪检测T淋巴细胞增殖，流式细胞术检测各组CD4+CD25+T细胞的百分率，RTPCR检测各组细胞Foxp3的相对表达量(Foxp3/βactin)，ELISA分别测定上清中TGFβ、IL10、IFNγ和IL12的表达。Pearson检验分析Foxp3相对表达量与CD4+CD25+T细胞百分率的相关性，以及Foxp3相对表达量、 CD4+CD25+T细胞百分率与T淋巴细胞增殖程度(counts per minute, CPM值)，细胞因子TGFβ、 IL10、IFNγ和IL12表达量的相关性。结果表明：hMSC能明显抑制T淋巴细胞增殖，且抑制作用与hMSC呈剂量依赖性;实验组各组CD4+CD25+T细胞亚群含量以及Foxp3相对表达水平均较对照组明显增加(p<0.05)，且实验组间比较差异仍具有统计学意义(p<0.05);Foxp3表达水平、CD4+CD25+T细胞百分率与T淋巴细胞增殖水平呈明显负相关(p<0.05)，与TGFβ、IL10表达量呈明显正相关，而与IFNγ和IL12的表达无明显相关性。 结论：hMSC呈剂量依赖性抑制同种异体淋巴细胞增殖, 其机制可能与hMSC通过分泌TGFβ、IL10促进CD4+CD25-T细胞向表达Foxp3的CD4+CD25+调节T细胞转化，进而发挥免疫抑制作用有关。

　　【关键词】 骨髓间质干细胞

　　Abstract The study was purposed to investigate the immune regulatory effects of human bone marrow mesenchymal stem cells (hMSCs) on Foxp3 expressing CD4+CD25+ regulatory T cells and to explore the mechanism of immune modulation by hMSCs. Human MSCs were isolated and expanded from bone marrow cells, and identified with cell morphology, and the phenotypes were assessed by immunohistochemistry. Human peripheral blood mononuclear cells (hPBMNCs) were prepared by centrifugation on a Ficoll Hypaque density gradient. The hMSCs(1×103，1×104，1×105) were added into wells containing hPBMNCs(1×106) from an unrelated donor in the presence of rhIL2. After 5 days of coculture, the percentage of CD4+CD25+T cells was detected by flow cytometry. T cell proliferation was assessed by [3H] thymidine incorporation using a liquid scintillation counter. The expression of Foxp3 in CD4+CD25+T cells was detected by reverse transcription polymerase chain reaction (RTPCR). Cytokines (TGFβ、IL12、IFNγ、IL10) concertrations of cultured supernatants were measured with ELISA. The results indicated that in all the experiments, the presence of hMSCs with hPBMNCs resulted in a statistically significant decrease in T cell proliferation, in dosedependent manner. The increase of percentage of CD4+CD25+T cells in the peripheral CD4+ T cell was observed after coculturing lymphocytes with hMSCs (p<0.01). The expression of Foxp3mRNA (Foxp3/βactin) in hMSCs groups was significantly higher than that in the control and was negatively associated with the value of CPM representing T proliferation. The levels of TGFβ and IL10 were higher in hMSCs groups than that in the control, and the levels of TGFβ and IL10 correlated positively with Foxp3mRNA expression and the percentage of CD4+CD25+T cells. However, the secretion of IL12 and IFNγ was significantly attenuated by hMSCs coculture, and there was no correlation with Foxp3mRNA expression and the percentage of CD4+CD25+T cells. It is concluded that the Foxp3 expressing regulatory T cells may play an important role in the immune regulatory by hMSCs. Its mechanism is related to that the hMSCsmediated TGFβ and IL10 convert CD4+CD25-T cells into CD4+CD25+T regulatory T cells, which specifically inhibits the proliferation of T cells.

　　Key words bone marrow mesenchymal stem cell; CD4+CD25+ T cell; Foxp3; immune regulatory

　　J Exp Hematol 2007; 15(4):785-789

　　中国实验血液学杂志 J Exp Hematol 2007; 15(4)人骨髓间充质干细胞对同种异体调节性T细胞的影响及可能机制实验研究 骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSC)因其具有独特的多向分化潜能[1]而在细胞治疗以及基因治疗领域展现出广阔的应用前景，成为研究者倍加关注的种子细胞。随着研究的深入，人们发现，MSC除具有上述功能外，还对同种异体免疫反应具有负性调节作用[2]，能降低同种异体移植后移植物抗宿主反应的发生率。众多学者对其可能的作用机制进行了研究，目前认为可能通过与免疫细胞(如T细胞，树突状细胞，B细胞等)直接接触[3]或通过改变细胞因子分泌网络间接影响免疫细胞发挥效应有关，但确切机制仍不清楚。近年来国外学者研究发现一个具有独特免疫调节功能的T细胞亚群：CD4+CD25+调节性T细胞。这群细胞具有免疫无能和免疫抑制特性，不仅能抑制自身免疫性疾病发生，还可能参与肿瘤免疫的调节[4]。这一发现被认为是近年来免疫学领域的重大突破，也是目前免疫学领域的研究热点之一。Aggarwal等[3]的研究表明，将骨髓间充质干细胞与同种异体单个核细胞共培养后，单个核细胞中CD4+CD25+T细胞的百分率增加，因此认为CD4+CD25+T细胞可能参与了骨髓间充质干细胞的免疫调节作用。近来的研究认为，在人类，并非所有表达CD25 标志的CD4 细胞都是具有免疫抑制性的调节细胞，但叉头蛋白3(Foxp3)是免疫抑制性CD4+CD25+调节性T细胞的共同标志[5]。因此，本实验进一步从分子水平研究了人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells, hMSC)对表达Foxp3的CD4+CD25+调节性T细胞的影响及其发挥负性免疫调节作用的可能机制，为将骨髓间充质干细胞应用于临床提供实验证据。

　　材料和方法

　　骨髓

　　骨髓来源者为我院门诊细胞学检测室健康自愿者，平均年龄31岁。

　　主要试剂和仪器

　　LDMEM、RPMI 1640、Lglutamine, 10%新生牛血清购自Gibico公司，淋巴细胞分离(Ficoll)液购自上海试剂二厂。SH2、SH3、SB21单克隆鼠抗人抗体购于福州脉新公司。PECD25+、FITCCD4+购自Biolegend 公司，IL2 购自深圳晶美公司。TGFβ、IL10、IFNγ和IL12 ELISA 试剂盒购于R&D公司。3HTdR由中国科学院上海原子核研究所提供。FACSCalibur 流式细胞仪为美国Becton Dickinson公司产品。

　　hMSC的分离培养、传代及鉴定

　　取肝素钠抗凝的骨髓3 ml，用等量的PBS稀释后，缓慢注入预先加入等量淋巴细胞分离液的离心管中， 444×g离心20分钟，吸取中间白膜层，用PBS洗涤， 111×g离心8分钟×2后，弃去上清，加入LDMEM悬浮，接种于25 cm2培养瓶中，于37℃，5% CO2、饱和湿度条件下培养，于接种3天后首次半量换液，以后隔日换液，在Olympus倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况，当细胞生长至80%融合时，用0.25%胰酶消化传代。于6孔板中放置无菌盖玻片，将胰酶消化的hMSC按2 ×104 /ml接种于6 孔板中，置37℃、5% CO2 ,饱和湿度条件下培养72小时后，用正常羊血清1∶20封闭，37℃孵育20分钟之后加入1∶20 单克隆鼠抗人抗体：SH2、SH3、SB21，37℃孵育30 分钟，4℃过夜。用PBS清洗2次后，依次加入生物素标记二抗及链霉亲合素，DAB显色后，HE复染细胞核。

　　人外周血单个核淋巴细胞的分离

　　取健康志愿者肝素抗凝外周血20 ml，加入淋巴细胞分离液， 444×g离心20分钟，吸取中间白膜层，用PBS漂洗2次，离心后得到单个核细胞备用。

　　实验分组

　　实验分为两组：①hMSC组：hMSC(1×103，1×104，1×105)+ hPBMNC+ IL2;②对照组：hPBMNC+ IL2+ PBS。

　　混合淋巴细胞增殖反应

　　将hMSC按数量级(1×103，1×104，1×105)分别与hPBMNC(1×106)(0在IL2(300 U/ml)存在时于96孔板共培养7天，对照组加入PBS，每组设3个复孔。结束培养前16小时加入3HTdR (0.5 μCi/well)，以多头细胞收集器收集细胞，用液闪计数仪检测CPM值，结果以3个孔的均值表示。

　　流式细胞术检测

　　将收集的非贴壁细胞浓度调整为1×106/ml，每管吸取100 μl，加入标记抗体PECD25+，FITCCD4+ 10 μl，4℃孵育20分钟，用PBS洗两遍，加入0.5 ml PBS重悬，以CD4+设门，流式细胞仪检测各组PBMNC中CD4+CD25+T细胞百分比。

　　hPBMNC Foxp3 mRNA表达水平的RTPCR检测

　　cDNA合成 利用TRIzoL提取外周血单个核细胞总RNA，取总RNA 2 μl进行逆转录反应合成cDNA，-80℃保存。

　　引物设计(上海博亚公司合成) Foxp3：上游5′AG GCTTCATCTGTGGCATCAT3′;下游5′CTTGCG GAACTCCAGCTCAT3′(产物443 bp)。内参照βactin：上游5′ATGGATGATGATATCGCGCG3′;下游5′CATGAAGCATTTGCGGTGGACGATGGAGG GGCC3(产物1 126 bp)。

　　PCR反应 94℃变性40秒、60℃ 退火40秒，72℃延伸60秒，35个循环。

　　成像扫描和检测 取PCR产物10 μl用2%的琼脂糖凝胶80 V，电泳30分钟，紫外灯下观察结果，用计算机凝胶成像系统扫描成像后，使用其分析软件检测样品灰度值，以βactin为内参照，计算相对含量，以Foxp3/βactin表示Foxp3 mRNA相对表达水平。

　　TGFβ、IL10 、IFNγ和IL12浓度测定

　　收集细胞培养上清液, 置于-70℃储存, 采用ELISA测定TGFβ、IL10 、IFNγ和IL12浓度。

　　统计学处理

　　采用SPSS l3.0统计软件，组间比较采用方差分析以及LSD检验， Pearson检验分析Foxp3 mRNA表达水平与其它检测指标的相关性。

　　结 果

　　hMSC的分离培养及表型鉴定

　　hMSC培养1 周左右，出现单个分散存在或几个细胞聚集的克隆，细胞的形态呈现均一长梭形。此后hMSC开始迅速增殖，至10-14天时细胞呈现90%以上的融合(图1)。免疫组织化学染色法显示，hMSC表面特异抗原SH2、SH3、SB21均呈阳性表达，胞膜可见大量棕黄色颗粒，PBS阴性对照未见类似颗粒(图2A, B, C)。

　　从健康志愿者外周血分选的单个核细胞与非亲缘供者hMSC共培养7天后，其T细胞亚群CD4+CD25+T细胞占CD4+T 细胞百分率较对照组显著升高，hMSC各组与对照组相比差异有统计学意义(p<0.05)。hMSC组之间两两比较亦有统计学差异(p<0.05)(表1) 。

　　淋巴细胞增殖

　　hMSC组T细胞增殖能力明显被抑制，与对照组相比，差异具有统计学意义(p<0.01)。同时，不同剂量hMSC组之间比较，差异仍有显著性(p<0.05)(图3)。

　　Figure 3. Effect of hMSC (1×103，1×104，1×105) on allogeneic T lmphocytes proliferation. hMSCs inhibit the proliferation of T lymphocytes in dose dependent manner. *p<0.05， compared with control.

　　细胞因子表达水平

　　hMSC各组(1×103，1×104，1×105)上清中TGFβ、IL10的表达水平均明显高于对照组，INFγ和IL12表达均明显低于对照组，组间比较差异有统计学意义(p<0.05)(表2)。

　　相关分析结果

　　Foxp3 mRNA表达水平与CD4+CD25+ T细胞百分率呈高度正相关(r=0.980， p<0.001)。 Foxp3 mRNA水平、CD4+CD25+ T细胞百分率与培养液上清TGFβ，IL10表达水平成正相关(r分别为0.819、0.762和0.843、0.756)，与T淋巴细胞增殖能力成负相关(r=-0.912、 p<0.001)。而与IFNγ和IL12表达水平无相关性。

　　讨 论

　　大量的研究认为，MSC不仅具有多向分化潜能而且具有独特的负性免疫调节能力。动物实验和临床研究均表明，使用非亲缘供者的MSC移植，可抑制受者体内的异基因免疫反应性。虽然已有临床实验将人MSC应用于预防移植物抗宿主排斥反应病[6]，但其发挥免疫调节作用的具体机制尚不明确。随着免疫学研究领域的飞速发展，学者们发现，在免疫系统内存在一群CD4+CD25+调节性T淋巴细胞可以通过下调对自身或非己抗原的免疫反应，在阻止免疫介导的疾病中起重要作用。Hori等[7]发现，转录因子Foxp3(forkhead box p3)特异性表达于调节性T细胞，与其生长发育和功能维持密切相关，可作为检测CD4+CD25+调节性T细胞一个较为特异性的指标。2005年，Aggarwal等[3]将骨髓间充质干细胞与同种异体单个核细胞在IL2存在时共培养72小时，结果显示骨髓间充质干细胞能明显抑制单个核细胞增殖，并且发现共培养后单个核细胞中CD4+CD25+T细胞所占百分率增加，因此认为CD4+CD25+T细胞可能参与了骨髓间充质干细胞的免疫调节作用。

　　我们的研究结果与Aggarwal等类似，加入不同数量级hMSC共培养后，同种异体淋巴细胞增殖受到显著抑制，抑制程度与且hMSC 数量呈剂量依赖性，并且CD4+CD25+T细胞占CD4+T淋巴细胞百分率较培养前明显增加。同时，我们进一步检测了共培养前后CD4+CD25+T细胞中Foxp3的表达以及培养上清中细胞因子TGFβ、IL10、IFNγ和IL12的表达水平。结果表明，hMSC组Foxp3的表达明显增强，增加的程度与hMSC数量呈剂量依赖性，同时抑炎因子TGFβ、IL10分泌增加，而促炎因子IFNγ和IL12分泌减少。Pearson相关分析显示：①Foxp3的相对表达量与CD4+CD25+T细胞百分率成高度正相关;②Foxp3的相对表达量，CD4+CD25+T细胞百分率与T淋巴细胞增殖数呈负相关，与抑炎因子TGFβ、IL10的表达呈正相关，而与促炎因子IFNγ和IL12的表达无明显相关性。

　　TGFβ、IL10是重要的抗炎性细胞因子，可通过对多种免疫效应细胞的抑制而发挥抗炎作用。但Tse等[8]发现，MSC抑制淋巴细胞增殖的能力，但这种作用并不依赖MSC 所分泌的TGFβ、IL10等因子。已有的研究证实，TGFβ是诱导Foxp3的关键因子，TGFβ调节人CD4+T细胞Foxp3表达，促进CD4+CD25-T细胞表达Foxp3转化成CD4+CD25+调节性T细胞[9]。因此，结合本实验的研究结果，我们推测这种作用可能与hMSC通过分泌抑炎因子TGFβ、IL10促进CD4+CD25-向表达Foxp3的CD4+CD25+调节T细胞转化，进而发挥免疫抑制作用有关。因此，hMSC是否通过分泌细胞因子诱导产生调节性T细胞从而介导免疫耐受, 以及调节性T细胞如何发挥免疫抑制作用的具体机制仍需要更深入地研究。

　　【参考文献】

　　1Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science, 1999; 284(5411): 143-147

　　2Bartholomew A, Sturgeon C, Siatskas M, et al. Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo. Exp Hematol, 2002, 30: 42-48

　　3Aggarwal S, Pittenger MF. Human mesenchymal stem cells modulate allogeneic immune cell responses. Blood, 2005; 105: 1815-1822

　　4Wolf AM，Wolf D, Steurer M, et al. Increase of regulatory T cells in the peripheral blood of cancer patients.Clin Cancer Res，2003; 9：606-612

　　5RWalker M， Kasprowicz DJ，Gersuk VH，et al.Induction of FoxP3 and acquisition of T regulatory activity by stimulated human CD4+CD25- T cells.J Clin Invest，2003; 112：1437-1443

　　6LeBlanc K, Rasmusson I, Sundberg B, et al. Treatment of severe acute graft versushost disease with third party haploidentical mesenchymal stem cells. Lancet, 2004; 363(9419):1439-1441

　　7Hori S，Sakaguchi S.Foxp3：a critical regulator of the development and function of regulatory T cells.Microbes Infect，2004;6：745-751

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　　9Fantini MC，Becker C，Monteleone G，et al.Cutting edge：TGFbeta induces a regulatory phenotype in CD4+CD25- T cells through Foxp3 induction and downregulation of Smad 7.J Inununol，2004;172：5149-5153