纳米羟基磷灰石/混旋聚乳酸修复牙槽突裂的实验研究

　　作者：胡图强， 何 俐*， 喻学洲， 周永庆 作者单位：(郧阳医学院附属人民医院口腔科,湖北 十堰 442000)

　　【摘要】 目的:研究纳米羟基磷灰石/混旋聚乳酸(nanoHA/PDLLA)复合材料修复牙槽突裂的愈合过程。方法:将40只雄性日本大白兔随机平均分成nanoHA/PDLLA和nanoHA两组。每只动物的两侧下颌骨均外科形成类似牙槽突裂样缺损。2个月后各组动物分别以上述两种材料充填修复牙槽突裂,于2周、4周、8周、12周和24周处死动物，采用组织学、组织形态学等方法观察样本。结果:所有动物均无围术期并发症发生。术后8周内nanoHA/PDLLA组的成骨活性明显低于对照组，而在12周后两组间无明显差异。术后第12周，两组材料均基本吸收。术后第24周，nanoHA/PDLLA组和对照组新骨平均丧失高度分别为修复高度的32.1%和12.4%。结论:nanoHA是牙槽突裂修复的良好生物材料， nanoHA/PDLLA由于其对新骨形成的抑制作用和新骨吸收比例较高，需作进一步研究。

　　【关键词】 纳米羟基磷灰石;混旋聚乳酸;牙槽突裂;修复

　　Experimental Study on Alveolar Cleft Repaired with NanoHA/PDLLA HU Tuqiang,HE Li,YU Xuezhou，ZHOU Yongqing (Department of Stomatology, Renmin Hospital, Yunyang Medical College,Shiyan,Hubei 442000,China)

　　Abstract:Objective To investigate the healing process of alveolar cleft repaired with NanoHA/PDLLA. Methods Forty male Japanese rabbits were randomly divided into NanoHA/PDLLA group and NanoHA group.Alveolar clefts were made by severing the mandible of each side,then repaired with the two kinds of materials respectively two months later.The animals were sacrificed at 2, 4, 8, 12 and 24 weeks postoperation. Histological and histomorphometric evaluation were carried out.Results There were no complication in all animals.The activity of osteblast in nanoHA/PRP group was significantly lower than that in control within 8 weeks after operation, but no signifiant after 12 weeks.The materials were absorbed completely in both groups 12 weeks postoperation.The proportion of average height of new forming bone lost in nanoHA/PDLLA group was 32.1%,while it was 12.4% in the control group 24 weeks postoperation.Conclusion NanoHA/PDLLA is a good biomaterial in repair of alveolar cleft,whereas its inhibitory effect and high absorption ratio of new bone need further study.

　　Key words:NanoHA;PDLLA;Alveolar cleft;Repair

　　牙槽突裂的修复主要是恢复上颌骨的连续性，为裂隙邻近和未萌出牙提供骨支持，并封闭口鼻瘘和前腭裂。牙槽突裂修复多采用自体松质骨移植，但存在供区并发症、愈合时间延长、后期骨吸收和治疗费用增加等问题，所以采用生物材料修复是一种新的探索。羟基磷灰石由于不能吸收不宜用于牙槽突裂修复。纳米羟基磷灰石组织相容性好，在体内可以完全吸收，已证实可用于骨组织缺损和牙槽突裂修复[1]，但因材料是粉状，临床上不易操作。本研究的目的是通过研究纳米羟基磷灰石/混旋聚乳酸(nanoHA/PDLLA)复合材料修复牙槽突裂的愈合过程，探讨其生物性能。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　PDLLA/nanoHA由武汉理工大学生物材料中心提供，PDLLA分子量(MV)为1.06×105，复合材料是在PDLLA中加入10%wt的nanoHA复合而成。

　　1.2 动物

　　将40只体重2.5～3.0 kg的雄性日本大白兔随机平均分成nanoHA组和nanoHA/PDLLA组。将各组动物随机分配到2周、4周、8周、12周和24周5个时间段中，每个时间段4只，按清洁级标准单笼饲养。

　　1.3 建立牙槽突裂动物模型和牙槽突裂修复

　　术前手术部位剪毛，碘伏消毒。所有动物均在全麻下进行手术，通过耳缘静脉注射质量浓度为20 g/L的戊巴比妥钠，30 mg/kg。于两侧下颌骨体部无牙区外科形成长7 mm、高5 mm牙槽突裂样楔形缺损。

　　动物模型建立2个月后，同样在全麻下行牙槽突裂修复术。每只动物两侧均植入相同材料。为了减少围术期感染，术中和术后连续3 d给予15%氨苄青霉素3 mL/kg肌肉注射。于术后2周、4周、8周、12周和24周处死动物。

　　1.4 组织形态学检查

　　使用精确度0.02 mm数显游标卡尺在骨标本上直接测量新骨表面最低点与相邻固有牙槽嵴顶之间的垂直距离为新骨骨吸收量，取三次测量的平均值进行统计学分析，测量和统计均由一人完成。

　　1.5 组织学检查

　　注射过量苯巴比妥钠处死动物,于植入材料外侧3 mm处行块状截骨，取出后以砂轮横向片切成两部分。一部分置于4%的多聚甲醛固定48 h后，流水冲洗24 h，然后置于10%的EDTA中脱矿，制成石蜡标本，5 μm切片，HE染色。另一部分置于中性3%戊二醛中固定48 h，切取 0.5 cm×0.4 cm×0.2 cm包含材料骨组织交界面的骨组织块，pH=7.3 PBS液冲洗， 1%四氧化锇固定液固定1 h，梯度酒精、丙酮脱水。干燥后喷金，扫描电镜(S570 Hitachi,日本)观察。剩余部分经PBS液充分冲洗，4.5%EDTA脱钙，pH=7.3 PBS液冲洗，1%四氧化锇固定，梯度酒精、丙酮脱水，环氧树脂定向包埋0.1 μm超薄切片，醋酸铀、枸橼酸铅双重染色，透射电镜(JM1200)观察。

　　1.6 统计学分析

　　组织形态学数据应用SAS统计软件进行统计分析，P<0.05有显著差异。

　　2 结果

　　2.1 大体观察

　　所有动物均无围手术期并发症发生。人工牙槽突裂形态大小基本一致，平均高约4.2 mm，牙槽嵴处平均裂隙宽约6.4 mm。术后第24周，两组材料均基本吸收。

　　2.2 组织形态学观察

　　每个标本于新骨表面取最低点，千分位游标卡尺测量其至相邻固有牙槽嵴顶的垂直距离，精确到0.02 mm。表1是每个时间段新骨表面最低点至牙槽嵴顶的垂直距离。表1 新形成骨表面最低点至牙槽嵴顶的垂直距离(x±s,mm)

　　材料/时间2周4周8周12周24周NanoHA组0.16+0.030.31+0.080.41+0.090.50+0.100.52+0.10nanoHA/PDLLA组0.34+0.050.60+0.090.79+0.101.22+0.141.35+0.17

　　两组各时间段比较，P均<0.05

　　2.3 光镜观察

　　术后2周， nanoHA组纤维组织较丰富，近固有骨处成骨细胞丰富，可见少量骨痂，有少量炎性细胞浸润(图1)。nanoHA/PDLLA组有大量炎性细胞浸润，植入材料与固有骨接触处见到少量成纤维细胞、成骨细胞和骨样组织，并可见较大空隙(图2)。术后4周和8周，nanoHA组有大量骨痂形成，骨痂改建明显;nanoHA/PDLLA组仍可见到少量炎性细胞，骨小梁疏松，纤维组织较多。

　　2.4 电镜观察

　　透射电镜观察，术后第2周，nanoHA组固有骨与材料之间可见到大量成骨细胞，成长柱形，胞核大，成卵圆形或梭形，含染色质颗粒，核仁明显。有丰富的线粒体和粗面内质网(图3)。nanoHA/PDLLA组成骨细胞数量较少，细胞器不发达，功能不活跃(图4)。

　　图3 术后第2周，nanoHA组可见大量成骨细胞，有丰富的线粒体和粗面内质网(10 000×)。图4 nanoHA/PDLLA组成骨细胞数量较少，细胞器不发达，功能不活跃(10 000×)。

　　扫描电镜观察，术后第8周，nanoHA组可见到较多骨髓组织及成熟骨细胞，固有骨与新骨之间为直接骨性结合，界面仍可清楚区别。植入材料已基本吸收，大量新骨已改建成板层骨(图5)。nanoHA/PDLLA组可以见到较大颗粒，有大量新骨形成(图6)。

　　图5 术后第8周，nanoHA组可见到较多骨髓组织及成熟骨细胞，固有骨与新骨之间为直接骨性结合，界面仍可清楚区别。植入材料已基本吸收，大量新骨已改建成板层骨(3 500×)。

　　图6 术后第8周，nanoHA/PDLLA组可见到较大颗粒，有大量新骨形成(3 500×)。

　　3 讨论

　　牙槽突裂影响语音功能，并影响到牙胚，导致受累牙的数目、形态以及位置发生变化，导致口颌畸形。目前牙槽突裂的手术修复主要采用自体髂骨松质骨移植。近年来，许多学者热衷于骨替代材料的研究，用于骨缺损修复，包括各种生物材料及添加生长因子。牙槽突裂修复材料与一般骨缺损修复材料相比，既有相同之处，又有其特殊要求。与一般骨修复材料相比，牙槽突裂修复材料还应具有以下特性：骨诱导性;能够吸收，而且可控制在一定时间内;促成骨作用。

　　纳米羟基磷灰石微结构类似天然骨基质，对细胞和生物材料之间的相互作用影响很大，在许多生物医学应用方面发挥了重要作用。在一些实验中纳米羟基磷灰石表现出了良好的生物相容性[2-3]，除了能在一定时间内吸收外，具有更良好的骨传导和骨诱导性能[4-5]。

　　混旋聚乳酸是一种非结晶态的聚乳酸，具有组织相容性好、在体内能够完全降解等特点，已大量用于骨缺损修复和颌骨骨折内固定。然而，由于PDLLA分子量低，其降解速度过快。未吸收的降解产物堆积过多，将影响到局部血流量和pH值，降低成骨细胞和成纤维细胞的活性，从而延缓了骨愈合过程[6]。近年来，一些学者利用工艺将HA和PDLLA混合在一起，既可增加PDLLA的强度和韧度，又便于HA成形，广泛应用于骨缺损修复，取得较好效果。Liao等[1-2,7-8]将nanoHA与PLLA、胶原、聚氨基葡糖、聚合物等复合，用于骨组织缺损修复或骨组织工程技术。本实验中， nanoHA/PDLLA便于成形，易于操作。PDLLA降解时产生的乳酸改变了局部骨组织的pH值，影响碱性磷酸酶活性，对骨愈合有一定的抑制作用;复合材料中nanoHA在酸性环境中溶解增速，溶解释放的Ca2+,PO43离子可能参与局部骨基质的钙化，并且纠正局部骨组织的pH值，对新骨的形成和骨结合有促进作用[9-10]。而且PDLLA降解时产生的空隙有利于成骨细胞、成纤维细胞和毛细血管的长入，可能缩短材料吸收时间和影响新骨形成与改建过程。

　　整个观察过程中，nanoHA与nanoHA/PDLLA组牙槽突裂植骨部位均正常愈合，表现出良好的生物相容性，无排斥反应。材料植入早期，材料与固有骨之间有丰富的毛细血管长入，材料周围有大量成骨细胞。12周时材料明显吸收，24周时材料吸收完全，新骨形成和改建基本完成。这提示了nanoHA对骨折愈合过程干扰作用很小[11]。nanoHA在体内的吸收时间和骨改建时间大约6个月左右，尽管比自体松质骨移植的骨形成和骨改建时间长，但不会影响尖牙的萌出。然而，一种生物材料能否适宜于牙槽突裂的修复，除了其能在一定的时间内吸收外还有一个重要因素，即材料植入后所能提供的新骨骨量。如果新骨量不足，将影响尖牙及牙槽突裂隙邻近牙的稳定性，甚至加大术后正畸治疗的难度。

　　新形成骨表面最低点至牙槽嵴顶的垂直距离为新骨丧失高度，体现了新骨吸收量。nanoHA组新骨平均丧失高度为12.4%，这种新骨吸收量基本不会影响到尖牙的萌出和上颌骨的稳定性。而nanoHA/PDLLA组第24周骨吸收量为32.1%，骨量不足将影响到尖牙和上颌骨的发育和生理功能，所以认为该比例的混合材料不宜用于牙槽突裂的修复。PDLLA降解过程中产生的降解产物的吸收以及降解产物对成骨细胞、破骨细胞、成纤维细胞等的影响可能与新骨吸收量有关。适当调整nanoHA和PDLLA的比例，增加混合材料中nanoHA的比重，可以减少单位时间内PDLLA中间产物量，改变局部生理环境，从而减小其对新骨形成的抑制作用和新骨吸收量，通过进一步研究，nanoHA/PDLLA有可能成为一种牙槽突裂修复的良好材料。

　　nanoHA是牙槽突裂修复的良好生物材料，该比例的nanoHA/PDLLA混合材料由于其对新骨形成的抑制作用和新骨吸收比例较高，需作进一步研究。

　　【参考文献】

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