变形链球菌基因疫苗pcDNA3gtfB鼻黏膜免疫家兔的实验研究

　　作者：王晶 刘建国 杨德琴 作者单位：1 滨州医学院附属医院口腔内科 滨州市 256603;2 遵义医学院口腔学院

　　【摘要】 目的 观察变形链球菌防龋基因疫苗pcDNA3gtfB经鼻腔黏膜免疫日本长耳大白兔后的免疫反应性，初步观察不同剂量质粒pcDNA3gtfB免疫机体后的抗体效价。方法 实验分两部分，第一部分：30只日本长耳大白兔平均分为5组，每组6只，分别为：200 μg、400 μg 、600 μg pcDNA3gtfB质粒组，400 μg pcDNA3组，灭活全菌疫苗阳性对照组。质粒组及全菌组以1：1比例添加弗氏佐剂后进行免疫，共免疫两次。第二部分：采用间接ELISA法检测血液、唾液中特异性IgG、SIgA。结果 ①血液、唾液中抗体高峰时间为初始免疫后8～10周左右;②自免疫后1～2周，各质粒组兔血液、唾液中特异性抗GTF的IgG、SIgA抗体水平同阴性对照组比较差异有统计学意义 (P<0.05);③200 μg组与400 μg及600 μg组比较多时点差异有统计学意义(P<0.05)。结论 ①基因疫苗pcDNA3gtfB具有免疫反应性;②200 μg 、400 μg、600 μg的基因疫苗对于体重1.5 kg左右的兔都是有效的免疫剂量;③在本研究的条件下，400 μg、600 μg疫苗组效价优于200 μg组。

　　【关键词】 基因疫苗;龋病;变形链球菌;葡糖基转移酶

　　Study on gene vaccine pcDNA3gtfB by intranasal immunization in rabbits

　　WANG Jing1 LIU Jianguo2 YANG Deqin2

　　1 Department of Oral Mediane,Affiliated Hospital of Binzhou Medical University, Binzhou 256603

　　2 School of Stomatology ,Zunyi Medical College

　　【Abstract】 Objective To investigate the efficiency of pcDNA3gtfB on Japan's Longeared rabbits by intranasal immunization, and observe the appreciate gene vaccine dose in rabbit immunization.Methods The study includes two parts. Part one: 30 Japan's Longeared rabbits were randomly divided into 5 groups(each group 6) as follows: 200 μg, 400 μg, 600 μg pcDNA3gtfB plasmid group，400 μg pcDNA3 group，inactivated wholecell vaccine positive control group.In the process of experiment the rabbits were immunized twice,and plasmid groups and wholecell group were coupled Freund’s adjuvant with 1∶1 ratio.Part two:The specific IgG and SIgA in blood and saliva were detected by indirect ELISA method.Results ①The peak time of the antibodies appeared between 810 weeks after the first immunization.②The specific antibodies IgG and SIgA could be detected 12 week after immunization.③The level of salivary specific SIgA and serum specific IgG of pcDNA3gtfB were significantly higher than negative groups (P<0.05). The titer of the 200 μg is significantly lower than those of 400 μg and 600 μg groups (P<0.05).Conclusion ①The recombinant plasmid pcDNA3gtfB has immunogenicity, which can induce specific immune responses in rabbits.②The results of the present study showed that 200 μg, 400 μg and 600 μg were effective immunizational dosage to 1.5 kilograms Japan's Longeared rabbits. ③400 μg and 600 μg pcDNA3gtfB can be considered as the optimal dosage at present experimental condition.

　　【Key words】 gene vaccine，dental caries，streptococcus mutans，glucosyltransferase

　　变形链球菌(Streptococcus mutans, S.mutans)是公认的重要致龋微生物之一[1]，而其葡糖基转移酶(glucosyltransferase, GTF)是与粘附作用有关的重要毒力因子。GTF能利用蔗糖合成葡聚糖，介导细菌的蔗糖依赖性粘附及细菌之间的聚集[2]。其中GTFI合成的水不溶性葡聚糖对细菌粘附尤为重要而备受重视[3]。杨锦波等[4]利用S.mutans葡糖基转移酶抗原表位基因gtfB构建pcDNA3gtfB，并进行了基因疫苗的动物免疫研究。杨德琴等[5]则证明了应用该核酸疫苗经颌下腺区注射可以诱导大鼠产生特异型抗体IgG和分泌型免疫球蛋白A (secretory immunoglobulin A, SIgA)，并具有防龋功能。本研究旨在应用重组质粒pcDNAgtfB经鼻腔黏膜免疫日本长耳大白兔，观察其免疫反应性;并且以三个不同剂量重组质粒pcDNAgtfB免疫长耳大白兔，以期摸索免疫的较佳剂量，为该基因疫苗的防龋应用提供一定的实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 质粒和菌种：重组质粒pcDNA3gtfB的E.coliJM109(四川大学华西口腔医学院龋病研究室提供);真核质粒pcDNA3的E.coliJM103(四川大学华西口腔医学院教育部口腔生物医学工程重点实验室提供)。UA159(S.mutans血清c型，四川大学华西口腔医学院龋病实验室提供)。主要试剂：羊抗兔HRPIgG(Amresco公司，美国),羊抗兔HRPIgA(Genetex公司，美国),弗氏佐剂(Sigma公司，美国),重组变形链球菌葡糖基转移酶(GTF,为本研究小组前期分离纯化),QIAGEN Plasmid Giga Kit(Qiagen公司，美国)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 质粒的制备：将含重组质粒pcDNA3gtfB或空质粒pcDNA3的E.coliJM109、E.coliJM103接种于含氨苄青霉素的LBAmpr液体培养基中, 于37℃恒温空气摇床剧烈振摇12 h，按QIAGEN试剂盒步骤大量抽提和纯化质粒。

　　1.2.2 灭活全菌体疫苗的制备：复苏变链菌UA159(血清c型)接种于TPY培养基中37°C恒温箱中，18h培养。挑取典型菌落革兰染色，常规镜下形态学鉴定。过夜培养和大体积培养。6 000 g离心10 min，0.5%福尔马林生理盐水液(v/v)灭活。0.1%福尔马林生理盐水液制成混悬液，使菌液浓度达8×108CFU/ml。

　　1.2.3 实验动物及分组：将购于第三军医大学野战外科研究所动物室的30只1.5 kg左右日本长耳大白兔，根据完全随机设计分组原则分为5组，每组6只，分别为：①pcDNA3gtfB 200 μg组;②pcDNA3gtfB 400 μg组;③pcDNA3gtfB 600 μg组;④空白组：pcDNA3 400 μg组;⑤阳性对照组：灭活全菌疫苗组。

　　1.2.4 免疫方法：采用经鼻腔黏膜途径免疫动物，首次免疫后间隔4周加强1次。采用弗氏佐剂为免疫佐剂，首次免疫时，全菌组、疫苗组均以1∶1比例添加完全弗氏佐剂，加强免疫时则用不完全弗氏佐剂。

　　1.2.5 唾液和血清的收集：分别于首次免疫前1 d和免疫后第1、2、3、4、6、8、10、12、14、15周采集静脉血、唾液样品。采集唾液时，用2%盐酸毛果芸香碱(0.2 mg/100 g)先行颈部皮下注射，而后收集唾液约2 ml，10 000 g离心10 min，弃杂质沉淀，-80°C保存。耳缘静脉采血，标本室温放置数小时，将血凝块挑出，4°C条件下5 000 g离心10 min，收集上清，-80°C保存。

　　1.2.6 酶联免疫吸附实验(间接ELISA法)检测血液、唾液中特异性IgG、SIgA：首先应用交叉连续稀释分析法[6]确定抗原包被的最佳浓度、酶标抗体的最佳工作浓度及待测样品最佳稀释浓度。将GTF稀释至10 μg/ml包被96孔板，3%牛血清白蛋白封闭，滴加100 μl待测血清( PBST 1∶10 稀释) 和唾液样本( PBST 1∶1 稀释)，37°C温育2 h，分别加入100 μl (1∶1 000)羊抗兔HRPIgG和羊抗兔HRPIgA(1∶5 000)。TMB底物显色，酶联检测仪测OD450值。

　　1.3 统计学分析 采用SPSS10.0统计软件分析。用x±s表示两种抗体的各时间点OD值水平，进行重复测量资料的方差分析，两两比较用LSD法。P<0.05认为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 唾液中SIgA型抗GTF抗体水平的观察 随时间变化各实验组兔唾液中SIgA型抗GTF抗体OD450值结果见表1。表1 各实验组不同时点兔唾液中SIgA型抗GTF抗体 经重复测量资料的方差分析：分组主效应有统计学意义(F=28.19，P<0.01)，表明各实验组兔唾液中SIgA型抗GTF抗体OD450值均数不全相同;时间主效应有统计学意义(F=8.42，P<0.01)，表明免疫后不同周数唾液中SIgA型抗GTF抗体OD450值均数有差别。各实验组均数间两两比较：除400 μg质粒组和600 μg质粒组、600 μg质粒组和全菌组唾液中SIgA型抗GTF抗体OD450值均数无统计学意义外，其他组间唾液中SIgA型抗GTF抗体OD450值均数有统计学意义。

　　随时间变化见图1。各质粒组在初始免疫后第8～10周出现抗体峰值，600 μg质粒组抗体效价较免疫前高2倍以上，阴性组免疫前后唾液中特异性抗体效价无显著性变化。图1 唾液中SIgA型抗GTF抗体浓度(OD450)变化趋势图

　　不同时间点组间SIgA型抗GTF抗体OD450值比较，各组同阴性组比较：从首次免疫后第3周开始，全菌组与阴性组相同时点之间比较差异均存在统计学意义(均为P<0.05)。第2～3周开始各质粒组同阴性组比较差异均存在统计学意义(均为P<0.05)。质粒组两两比较：200 μg组和 400 μg组之间各时点比较，在免疫后采样的10个时点中5时点差异存在统计学意义(P<0.05)。200 μg组和600 μg组之间比较8时点差异存在统计学意义(P<0.05)。

　　2.2 血液中IgG型抗GTF抗体水平的观察 随时间变化各实验组兔血液中IgG型抗GTF抗体OD450值，结果见表2。　表2 各实验组不同时点兔血液中IgG型抗GTF抗体OD450值

　　经重复测量资料的方差分析：分组主效应有统计学意义(F=32.36，P<0.01);表明各实验组兔血液中IgG型抗GTF抗体OD450值均数不全相同;时间主效应有统计学意义(F=8.20，P<0.01)，表明免疫后不同周数血液中IgG型抗GTF抗体OD450值均数有差别。各实验组均数间两两比较：除400 μg质粒组、600 μg质粒组和全菌组的血中IgG型抗GTF抗体OD450值均数差别无统计学意义外，其他各组间均数差别均有统计学意义。

　　随时间变化见图2。各质粒组在初始免疫后第8～10周出现抗体峰值，600 μg质粒组抗体效价较免疫前高2倍以上，阴性组免疫前后血清特异性抗体效价无显著性变化。

　　图2 血液中IgG型抗GTF抗体浓度(OD450)变化趋势图

　　各组同阴性组IgG型抗GTF抗体OD450值比较：从首次免疫后第1～2周开始，阴性组与全菌组和质粒组相同时点之间比较差异存在统计学意义(P<0.05)。质粒组之间比较：200 μg组和 400 μg组除第1周外，其它9时点差异均有统计学意义(P<0.05);200 μg组和 600 μg组之间比较亦为相同的结果。

　　3 讨论

　　葡糖基转移酶是变形链球菌的重要制龋毒力因子，自针对该酶的基因疫苗pcDNA3gtfB被构建成功以来，已有将此种重组质粒经颌下腺周注射免疫小鼠和大鼠的研究报告[4，5]，但是用此种质粒免疫兔的实验报告却鲜见。

　　免疫途径对免疫效果至关重要，在各种免疫途径中，黏膜途径已经成为基因免疫与基因治疗领域的共识。随着对黏膜免疫系统研究的深入，目前已明确唾液中的分泌性SIgA抗体对防龋起主要作用。唾液SIgA抗体对抗致龋菌的机制包括干扰细菌对牙面的蔗糖非依赖性和蔗糖依赖性黏附，干扰细菌在牙面的聚集以及可能抑制细菌的代谢活动。因此通过黏膜免疫刺激共同黏膜免疫系统(common mucosal immune system, CMIS)，诱导唾液SIgA抗体是更为有效的免疫防龋途径，更容易被接受，也更安全[7]。与肠道黏膜途径相比，鼻黏膜免疫可以避免抗原暴露在胃肠道恶劣的环境中，包括酸性环境，降解酶等;与生殖道黏膜途径相比，鼻黏膜途径更文明，更容易操作，更容易被接受。

　　本研究结果表明，从免疫后第1～3周开始兔的血清和唾液中开始出现特异性IgG和SIgA。直到本实验结束时，在接近12～14周的时间内，各质粒组检测到特异性抗体与阴性组差异有统计学意义。这提示pcDNA3gtfB不仅可以刺激机体产生抗体，而且能够在体内存在一定时间。本研究采用了200 μg、400 μg、600 μg三种不同剂量的pcDNA3gtfB基因疫苗进行免疫效果的研究，以期发现较佳的免疫剂量。从ELISA的结果来看，200 μg、400 μg和600 μg均可以刺激出与阴性组差异有统计学意义的特异的抗体。

　　对于龋病这样一个多因素疾病，时间是致龋的一个重要因素，较长时间高水平的抗体效价更有防龋意义。在一定范围内，外源基因在体内的表达呈剂量相关性，但当质粒注射量增加到一定程度时，就出现了饱和现象，即再继续增加DNA的注射量，蛋白表达也不会增加[8]。本研究数据显示，400 μg、600 μg的效价优于200 μg组，但是pcDNA3gtfB 400 μg组和600 μg组血液和唾液中抗体效价多数时间差异无统计学意义。出现这种情况的原因也许可以从抗原结构对免疫反应的影响解释：抗原具有成百上千的位点和抗原决定簇，但暴露于抗原表面并决定其是否具有感染或是可以被免疫抗体所抑制的位点通常只有数个，而此结构是最终决定免疫反应有效性的关键[9]。

　　综上所述，基因疫苗pcDNA3gtfB具有较好的免疫反应性，鼻黏膜免疫途径是一种方便有效的免疫途径。200～600 μg的pcDNA3gtfB基因疫苗对于1.5 kg左右、约8周龄的兔都是有效的免疫剂量，可以诱导出与阴性组差异有统计学意义的特异性抗体，且400 μg、600 μg质粒组效价优于200 μg组。

　　【参考文献】

　　[1] MatsumotoNakano M, Fujita K,Ooshima T. Comparison of glucanbinding proteins in cariogenicity of Streptococcus mutans[J]. Oral Microbiol Immunol,2007,22(1):305.

　　[2] Smith DJ, Taubman MA, King WF. Immunological characteristics of a synthetic peptide associated with a catalytic domain of mutans streptococcal glucosyltransferase[J]. Infect Immun, 1994, 62(12):54706.

　　[3] 樊明文.口腔生物学[M]. 北京：人民卫生出版社, 2004:238247.

　　[4] 杨锦波. 变形链球菌葡糖基转移酶抗原表位基因真核表达质粒的构建及其免疫动物实验研究[D]. 四川大学博士研究生论文, 2001.

　　[5] 杨德琴, 刘天佳, 曹福娴, 等. 变形链球菌表面蛋白和葡糖基转移酶基因疫苗免疫防龋实验研究:唾液和血清抗体水平测定[J]. 华西口腔医学杂志, 2003, 21(5): 396399.

　　[6] 巴德年.当代免疫学技术与应用[M]. 北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社, 1998: 3970.

　　[7] 樊明文. 关于免疫防龋[J]. 中华口腔医学杂志, 2006, 41(5):279281.

　　[8] 冯志华, 王全楚.新概念疫苗[M]. 北京：人民卫生出版社, 2004:81.

　　[9] 董德祥.疫苗技术基础与应用[M]. 北京：化学工业出版社, 2002: 3233.