慢性牙周炎患者基础治疗前后龈沟液中IL-17的表达变化

　　作者：周艳 ,徐艳 作者单位：(1南京医科大学口腔医学研究所，南京210029;2南京医科大学附属口腔医院牙周科;3南通市口腔医院)

　　【摘要】 目的：研究慢性牙周炎患者牙周基础治疗前后龈沟液中IL-17表达水平的变化及其与牙周临床指标的相关性，探讨IL-17在牙周炎发生发展中的作用。方法：采集30例慢性牙周炎患者的炎症牙位治疗前后的龈沟液，用酶联免疫吸附分析法(ELISA)检测龈沟液中IL-17的浓度和总量。同时记录治疗前、后患牙的探诊深度(PD)、临床附着丧失(CAL)、牙龈指数(GI)和菌斑指数(PLI)。结果：IL-l7浓度和总量在牙周基础治疗前显著上调(P<0.05)，且IL-l7浓度、总量与探诊深度(PD)、牙龈指数(GI)、临床附着丧失(CAL)呈正相关(P<0.01、P<0.05、P<0.05)。结论：在慢性牙周炎的发生发展中，IL-l7发挥了重要的致炎作用。龈沟液中IL-l7的浓度、总量与牙周组织炎症程度呈正相关，可以作为提示牙周炎活跃期的一个信号分子。

　　【关键词】 慢性牙周炎;龈沟液;白细胞介素-17

　　The changes of IL-17 levels in gingival crevicular fluid of chronic periodontitis pre- and after- periodental non-surgical treatment

　　ZHOU Yan 1,2，3, XU Yan1，2 (1Institute of Stomatology, Nanjing Medical University, Nanjing 210029; 2Department of Periodontics, Affiliated Hospital of Stomatology, Nanjing Medical University; 3 Stomatological Hospital of Nantong)

　　[Abstract] Objectives: To study the changes of IL-17 levels in gingival crevicular fluid(GCF) of chronic periodintitis(CP) pre- and after- periodontal non-surgical treatment and the relativity between them and periodontal indexes and to research the effect of IL-17 in pathogenesis and progression of CP. Methods:GCF samples were obtained from 30 inflamed teeth of CP pre- and after- periodontal non-surgical treatment, the concentration and total amounts of IL-17 were detected by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA), and at the same time, probing depth(PD), clinical attachment loss(CAL), gingival index(GI) and plaque index(PLI) were evaluated pre- and after- therapy.Results: The concentration and total amounts of IL-17 in GCF of CP pre- periodontal non-surgical treatment were upregulated.Furthermore, IL-I7 concentration. and total amounts showed statistical positive correlations with PD,GI and CAL (P<0.01, P<0.05 and P<0.05). Conclusion: IL-I7 plays an important role of triggering inflammatory reactions in the pathogenesis and progression of CP, and IL-I7 concentration and total amounts may show significant correlations with periodontal tissue inflammation. It may be used as a signaling molecule to hint active phase of CP.

　　[Key words] Chronic periodontitis;Gingival crevicular fluid;Interleukin-17

　　牙周炎是导致成年人失牙的主要原因之一。尽管牙周炎发生的始动因素为菌斑细菌，但牙周炎的临床病损却主要是机体免疫系统对抗菌斑微生物而产生的一系列免疫炎症反应导致机体继发损伤造成。由此可见，在牙周炎的发病机制中，机体的免疫系统起到重要作用。近年来，众多学者关注龈沟液(Gingival Crevicular Fluid，GCF)中的不同细胞因子与牙周炎活动期的相关性研究[1-4]。其中，Th17型细胞因子是新近发现的一类前炎症因子功能家族，而白细胞介素-17(Interleukin-17，IL-17)是Th17型细胞因子中一个最关键的促炎症性细胞因子[5]，本研究通过检测牙周基础治疗前后慢性牙周炎患者GCF中IL-17水平的变化和分析其与牙周临床指标相关性,初步探讨IL-17在慢性牙周炎发生发展过程中的作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 病例选择和治疗 30例慢性牙周炎(chronic periodontitis，CP)患者来自我院牙周科门诊，男性19例，女性11例，年龄30～61岁，平均44岁;每例患者选择1颗磨牙作为研究牙，所有研究对象符合以下条件：①无系统性疾病;②过去6个月内无牙周治疗史;③过去3个月内无抗生素、非甾体类抗炎药及免疫抑制剂应用史;④妇女未妊娠;⑤3 mm≤牙周探诊深度(Probing Depth，PD)≤8 mm。采集患者研究牙位的GCF并进行牙周临床指标检查后，患者分别接受详细的口腔卫生指导、全口龈上洁治、龈下刮治和根面平整，用尖探针探查根面直至感觉光滑无牙石为止。3%过氧化氢和生理盐水交替冲洗牙周袋，并于牙周袋内置碘甘油。治疗后6周复查，所有患者牙周临床指标的检查及牙周基础治疗均由同一名有经验的临床医师完成。

　　1.2 龈沟液采集和牙周临床指标检查 患牙以棉花卷隔湿，使用Silness和Loe法(1963)记录菌斑指数(Plaque Index，PLI)，去除龈上结石，轻吹牙龈，1 min后将消毒的滤纸条(2 mm×20 mm)轻轻插入龈沟或牙周袋内，遇阻力即止，停留30 s取出(如被血污染则弃除)。取出后用Sartorius BS124S分析天平(误差d=0.0001 g)称重，减去原重量，按比重为1换算成体积。称重后样本立即放人盛有200 μl磷酸盐缓冲液(PBS)中，-80 ℃冻存备用。检查记录各研究牙位的牙龈指数(Gingival Index，GI)(Loe和Silness法，1963，1967)、PD和临床附着丧失(Clinical Attachment Loss，CAL)。

　　然后根据治疗计划对患者进行牙周基础治疗。治疗后6周复查研究牙位，重复前述步骤。

　　1.3 酶联免疫吸附试验(ELISA)按R&D的Human ELISA Kit说明书操作，步骤如下：(1)包被：用PBS适当稀释包被抗体，以100 μl/孔加入96孔酶标版，4 ℃过夜;(2)封闭：弃去包被抗体，400 μl/孔PBS-0.05%Tween20洗涤3次，加入封闭液(PBS-1%BSA)300 μl/孔，室温孵育2h;(3)弃去封闭液，400 μl/孔PBS-0.05%Tween20洗涤3次，加入待测培养上清样品和被比稀释的标准品100 μl/孔，室温孵育2h;(4)弃去样品和标准品，400 μl/孔PBS-0.05%Tween20洗涤三次，加入稀释好的检测抗体100 μl/孔，室温孵育2 h;(5)弃去检测抗体，400 μl/孔PBS-0.05%Tween20洗涤三次，加入亲和素-HRP100 μl/孔，室温避光孵育20 min;(6)弃去亲和素-HRP，400 μl/孔PBS-0.05%Tween20洗涤三次，加入底物100 μl/孔，室温避光孵育20 min;(7)加入终止液：50 μl/孔;(8)读板：酶标仪450 nm波长处测OD值;(9)根据标准曲线计算样本细胞因子浓度。

　　1.4 统计学方法 采用SPSS11.5统计软件进行统计分析，计量资料数据均采用X±s表示，牙周基础治疗前后龈沟液中IL-17水平的变化采用配对t检验，IL-17的表达与牙周临床指标的相关性用直线相关分析。

　　2 结 果

　　2.1 经牙周基础治疗后，慢性牙周炎患者患牙GCF中IL-17的浓度、总量均明显降低，治疗前IL-17的平均浓度为(63.4731±19.4746) ng/ml，治疗结束后6周下降至(40.0069±10.9361) ng/ml(图1)。IL-17总量在治疗前的平均值为(112.7553±39.4035) pg，治疗结束后6周下降至(68.1716±4.7408) pg(图2)。上述差异均有统计学意义(P<0.05)。

　　2.2 慢性牙周炎患者基础治疗前后患牙牙周临床指标的变化 治疗后，所有患牙的PLI、GI、PD、CAL均较治疗前显著下降(P<0.05)，表明牙周临床症状明显改善(表1)。

　　2.3 IL-17与牙周临床指标的相关性 对慢性牙周炎患者基础治疗前IL-17的浓度、总量与各临床指标的相关分析显示，GCF中IL-17的浓度、总量与GI、PD、CAL呈显著正相关(P<0.05，P<0.01，P<0.05)。其相关系数r和P值见表2。

　　3 讨 论

　　GCF是结缔组织内的液体不断通过龈沟内壁上皮和结合上皮进入龈沟内所形成的[6]，牙周病时龈沟液内含有多种可作为炎症信号指标的细胞因子，近年来学者们对龈沟液内的细胞因子在牙周炎发生发展中作用的研究很多。Th17型细胞因子是一类新近发现的前炎症因子功能家族，IL-17是Th17型细胞因子中一个最关键的促炎症性细胞因子[5]，它们的发现补充了以往用Th1/Th2理论无法解释的免疫学机制[7]，也揭秘了其在牙周炎发生发展中缺失的重要一环。IL-17是由活化的记忆T细胞产生的，它具有强大的招募中性粒细胞的作用，调节并促进多种炎性介质的产生。大量的实验证据表明，IL-17参与了机体多种炎性疾病，与感染、肿瘤、过敏、移植及自身免疫性疾病均有密切关系[8-9]。

　　尽管以IL-17为代表的Th17型细胞因子在牙周疾病致病机制中的作用研究还刚刚开始，仍然不断有增加的证据证明，它们参与到牙周疾病的发病机制中，如Cardoso等[10]在慢性牙周炎组织内找到了浸润的Th17细胞。Johnson等[11]的研究发现，在治疗前，慢性牙周炎患者的龈沟液中IL-17的水平较正常人是明显上升的。Oda等[12]发现，慢性牙周炎的主要致病菌牙龈卟啉单胞菌能够促进CD4+ T细胞分泌IL-17，从而诱导CD4+ T细胞向Th17细胞分化。以上研究均有力地支持IL-17在牙周炎症活动期是上调的，本实验通过对龈沟液中IL-17浓度及总量变化的研究发现，炎症牙位治疗前的龈沟液中IL-17浓度明显高于治疗后，此结果与以往的研究结果一致。

　　本实验从局部免疫因素入手，治疗前后牙位的龈沟液中IL-17浓度差异也说明了IL-17在局部组织炎症中的作用[12]。牙周基础治疗是对每个牙周炎患者都适用的最基本的治疗方法。经基础治疗后6周复查，所有研究牙的牙周临床指数(PLI、GI、PD、CAL)伴随IL-17浓度显著下降，相应显著下降，牙周临床症状明显改善。

　　本实验中IL-17浓度、总量与各临床指标的相关分析显示，GCF中IL-17的浓度、总量与GI、PD、CAL呈显著正相关，说明IL-17浓度与牙周组织的炎症破坏程度有密切关系。综上所述，IL-17在牙周炎的发生发展过程中可能起重要作用，是致牙周组织炎性破坏的重要原因之一。因而提示可以把龈沟液中IL-17浓度、总量作为反映牙周炎症活跃期的一个信号指标。对慢性牙周炎患者龈沟液中IL-17和相关前炎症因子(IL-1β、IL-6、TGF-β、IL-21)的浓度水平检测有助于阐明Th17型细胞因子在慢性牙周炎发生发展中的作用，从而为临床慢性牙周炎的诊治提供帮助。

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