骨髓间充质干细胞复合多孔纳米羟磷灰石/聚酰胺6整复大鼠颅骨缺损的实验研究

　　作者：高莺1，2 李继华1 李玉宝3 左奕3 胡静1 马永清1 王雪梅1 作者单位：(1.口腔疾病研究国家重点实验室，四川大学，四川 成都 610041;2.山西医科大学第一医院 口腔科, 山西 太原 030001;3.四川大学 纳米生物材料中心，四川 成都 610041)

　　【摘要】 目的 初步探讨纳米羟磷灰石/聚酰胺6(n-HA/PA6)多孔材料对体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞(BM-SCs)增殖及分化的影响，以及BMSCs作为种子细胞、多孔n-HA/PA6作为支架材料构建组织工程化骨修复大鼠颅骨极限骨缺损的可行性及整复效果。方法 矿化诱导的第3代BMSCs与n-HA/PA6多孔材料复合培养，MTT检测细胞增殖，ALP染色检测骨向分化。将BMSCs与n-HA/PA6复合物植入大鼠颅骨8 mm骨缺损处，4、8、16周时，应用组织学、扫描电镜观察植入物与骨组织交界处的成骨修复情况，并与单纯n-HA/PA6植入组修复效果进行比较。结果 与n-HA/PA6复合培养的BMSCs生长良好，细胞增殖未受影响，ALP染色阳性。BMSCs复合n-HA/PA6植入4周时，有较多新骨长入支架孔穴;8周时，材料和宿主骨融为一体，接近正常骨;16周时，材料和天然骨形成骨性结合。单纯n-HA/PA6组植入4周时，新骨形成较少;8周时，新骨明显增加，但骨钙化程度较低;16周时，2组无明显差异。结论 多孔n-HA/PA6支架材料对种子细胞BMSCs的增殖和骨向分化无影响;BMSCs作为种子细胞、n-HA/PA6多孔复合体作为支架材料构建组织工程化骨能够加速界面骨愈合，有效修复颅骨缺损，具有潜在的骨组织工程应用前景。

　　【关键词】 骨髓间充质干细胞; 纳米羟磷灰石/聚酰胺6; 颅骨缺损

　　Reconstruction of critical sized calvarial defects by porous nano-hydroxyapatite/polyamide 6 composite with bone marrow mesenchymal stem cells in rat GAO Ying1，2, LI Ji-hua1, LI Yu-bao3, ZUO Yi3, HU Jing1, MA Yong-qing1, WANG Xue-mei1. (1. State Key Laboratory of Oral Diseases, Sichuan University, Chengdu 610041, China; 2. Dept. of Stomatology, The First Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China; 3. Research Center of Nano Biomaterials, Sichuan University, Chengdu 610041, China)

　　[Abstract] Objective To evaluate the effects of the nano-hydroxyapatite/polyamide 6(n-HA/PA6) on the prolifer-ation and osteoblastic differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs), and the feasibility of usingboth for constructing tissue engineered bone in the calvarias of rats with critical sized defects. Methods The third passage of BMSCs were cultured in osteoblastic medium and seeded on the scaffolds of n-HA/PA6, the proliferation of the BMSCs was tested by MTT(3-{4,5-dimethylthiazol-2yl}-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium-bromide) on scheduleddates, and the osteoblastic differentiation of the BMSCs were measured by alkaline phosphatase(ALP) staining. Fur-thermore, the scaffolds with or without BMSCs in rat calvarial defects, after 4 weeks, 8 weeks, and 16 weeks have been implanted. Histology and scanning electron microscope were used to test the bone healing in the different groups. Results The BMSCs seeded on the n-HA/PA6 grew well, the proliferation of cells was not affected by the scaffold, and the staining of ALP was also positive. At 4 week and 8 week after implantation, the n-HA/PA6 with BMSCs showed more new bone formation on the surface of scaffolds, with a better osseointegration of implant and host bone when compared with the group of n-HA/PA6 without BMSCs. However, there was no significant difference between these two groups at 16 week. Conclusion The porous n-HA/PA6 has no negative effects on the proliferation and osteoblastic differentiation of rat BMSCs, and using BMSCs as seed cells and n-HA/PA6 as scaffolds is a good choice for constructing tissue engineered bone due to the enhanced new bone formation and osseointegration.

　　[Key words] bone marrow mesenchymal stem cells; nano-hydroxyapatite/polyamide 6; calvarial defects

　　组织工程化骨由种子细胞、生物支架材料2大元素构建而成，其发展克服了自体或同种异体骨移植等传统骨缺损修复方法取材有限、并发症多的弊端，为修复大面积骨缺损提供了全新思路，成为骨缺损治疗新的突破点。种子细胞要求具有来源广泛、易于接种存活、稳定性好等特点，更为重要的是细胞在特定环境下能够实现快速扩增，并具有较强的成骨向分化能力[1-2]。而生物支架材料则不仅要起到支撑作用，维持原有组织外形，还需起到三维模板作用，为最初的细胞黏附、增殖和分化提供场所，并为随后的受损组织再生提供引导[3-4]。本研究通过大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesen-chymal stem cells，BMSCs)与新型多孔纳米羟磷灰石/聚酰胺6(nano-hydroxyapatite/polyamide 6，n-HA/PA6)复合体外培养，观察支架材料对BMSCs增殖和骨向分化的影响;并运用此细胞—支架复合体修复SD大鼠颅骨极限缺损，以探讨BMSCs作为种子细胞、n-HA/PA6多孔复合体作为生物支架材料构建组织工程化骨的骨缺损修复效果。

　　1 材料和方法

　　1.1 实验动物、主要试剂

　　健康成年SD大鼠，体重280～350 g, 雌雄不限，由四川大学华西医学中心实验动物部提供。LG-DMEM培养基购自美国Gibco公司，胎牛血清购自美国Hyclone公司，地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C、维生素D3均购自美国Sigma公司。

　　1.2 大鼠骨髓BMSCs的体外分离、培养

　　将SD大鼠处死，无菌条件下取其股骨、胫骨，剪去骨骺端，用注射器冲出骨髓，与含10%FBS的LG-DMEM培养基制成细胞悬液，在37 ℃、5%CO2的培养箱内贴壁培养，每2~3 d换液。当细胞70%～80%融合时，用0.25%胰酶消化，1∶2比例传代。从第3代BMSCs开始，置于骨向诱导液中培养：含10% FBS的LG-DMEM、10 nmol·L-1地塞米松、10 mmol·L-1 β-甘油磷酸钠、0.05 mmol·L-1左旋抗坏血酸。培养过程中，每天在倒置相差显微镜下观察细胞生长情况、形态变化，并照相记录。

　　1.3 n-HA/PA6多孔支架材料的制备

　　n-HA/PA6由四川大学纳米生物材料研究中心及分析测试中心提供，以NaCl为致孔剂，采用粒子沥滤-相转移法制备。该材料是三维多孔立体结构：孔径50~300 μm，平均孔径180 μm，大孔壁上存在丰富的微孔，孔径约0.5~50 μm，孔隙率67%，且孔间相互贯通(图1)。将制备好的n-HA/PA6切割成直径8 mm、厚1 mm的小圆片，环氧乙烷消毒备用。图 1 n-HA/PA6多孔仿生材料 SEM × 40Fig 1 Micrograph of n-HA/PA6 SEM × 40

　　1.4 矿化诱导的第3代BMSCs与n-HA/PA6多孔仿生

　　材料复合培养直径为8 mm的圆形多孔n-HA/PA6薄片在矿化诱导液中浸泡24 h后，将矿化诱导10 d的第3代BMSCs滴加在材料表面，5% CO2、37 ℃孵箱中培养，隔天换液。在复合培养第1、3、5、7、9天时进行MTT比色法检测细胞增殖：每孔加入MTT溶液40 μL，在37 ℃孵箱中孵化4 h后，弃上清并加入DMSO150 μL，在490 nm波长下测其光密度值。在复合培养1周时，用胰酶消化细胞，接种于盖玻片上，24 h后进行碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)染色：细胞爬片取出，PBS洗涤，多聚甲醛固定15 min，ALP孵育液孵育20 min，流水冲洗，醋酸溶液浸泡1 min，蒸馏水冲洗，甘油明胶封固。将MTT和ALP染色结果与单纯矿化诱导的第3代同期BMSCs检测结果进行比较，以观察n-HA/PA6对BMSCs增殖、分化的影响。

　　1.5 种子细胞—支架材料复合体体内植入实验

　　SD大鼠52只，体重280～350 g, 随机分为3组：1组植入n-HA/PA6与种子细胞复合体(24只)，1组植入n-HA/PA6(24只)，另设4只空白对照组(缺损区不植入任何材料)。将大鼠顶部备皮，10%水合氯醛(3.3 mL·kg-1)腹腔注射麻醉，无菌条件下头顶皮肤作弧形切口，剥离暴露颅骨，用裂钻制造直径8 mm极量骨缺损, 根据分组情况植入相应材料，缝合切口。术后第4、8、16周，BMSCs与n-HA/PA6复合组、单纯n-HA/PA6材料组各处死8只动物获取颅骨标本，空白对照组则仅在术后第16周获取样本，分别进行组织学、扫描电镜检测。

　　1.6 组织学检查

　　福尔马林固定7 d，EDTA脱钙20 d，经石蜡包埋后，连续切取厚约5 μm的组织切片，进行苏木精-伊红染色，光学显微镜下观察新骨形成情况。对BMSCs与n-HA/PA6复合组、单纯n-HA/PA6材料组第4、8、16周切片采集图像后进行计算机图像分析，统计新生骨组织在骨缺损区所占的面积百分比。

　　1.7 扫描电镜检查

　　样本依次经过PBS清洗、戊二醛固定、PBS清洗、锇酸固定、50%~100%乙醇梯度脱水、醋酸异戊酯浸泡、临界点干燥、表面喷金，观察并拍照。

　　1.8 统计学方法

　　用SPSS 10.0软件对数据进行统计学分析。组间比较采用t检验，P<0.05认为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 MTT生长曲线

　　以时间为横坐标，光密度值为纵坐标绘制生长曲线(图2)，结果显示：材料组与对照组之间细胞增殖差异无统计学意义(P>0.05)，提示n-HA/PA6对矿化诱导培养的BMSCs的生长和增殖无影响。

　　2.2 ALP染色

　　矿化诱导BMSCs复合n-HA/PA6培养1周后，所得细胞爬片ALP染色均为阳性，胞浆中可见红黑色颗粒(图3)。结果与单纯矿化诱导培养的第3代BMSCs相同，说明n-HA/PA6支架材料对矿化诱导培养的第3代BMSCs的成骨细胞表征没有影响。

　　2.3 组织学观察

　　BMSCs复合n-HA/PA6组植入4周时，在植入体与原骨组织交界处可见较多成骨细胞，有新生骨小梁形成;8周时，植入体和天然骨组织界面可见较多向材料侧延伸的新骨形成，较成熟，含有骨小梁，其内骨陷窝增多，周边可见成骨细胞，但新骨矿化程度较天然骨低(图4)。图 2 材料组与对照组细胞MTT生长曲线Fig 2 MTT growth curves of BMSCs from n-HA/PA6 group andcontrol group图 3 矿化诱导的BMSCs复合n-HA/PA6培养1周后ALP阳性染色ALP染色 × 400Fig 3 ALP positive staining in the osteoblastic differentiated BMSCsseeded on the scaffolds of n-HA/PA6 for one week ALPstaining × 40016周时，材料和天然骨组织界面可见大量成熟新骨形成，并伸入材料的空隙内，形成骨性结合。与之相比，单纯n-HA/PA6组4、8周时样本显示：植入体和原骨组织界面之间胶原纤维多一些，新生骨小梁少一些，成骨量亦少，且不成熟;16周时则与BMSCs复合n-HA/PA6组无明显差别。骨组织形态学测量显示(表1)：修复性新骨的面积百分比随时间而增长，4、8周时BMSCs复合n-HA/PA6组高于单纯n-HA/PA6组(P<0.05)，16周时，2组间无显著差异(P>0.05)。

　　2.4 扫描电镜观察

　　术后4周，BMSCs复合n-HA/PA6组在植入体和原骨组织界面大片散在网织状骨，新骨组织融合成板层骨，而单纯n-HA/PA6组在材料和原骨组织界面仅有少量新骨形成;术后8周，BMSCs复合n-HA/PA6组植入体表面完全被新骨组织覆盖，界面达到骨性整合，而单纯n-HA/PA6组植入体和原骨组织界面虽然新骨形成较4周时有所增加，但密度较低;术后16周，BMSCs复合n-HA/PA6组和单纯n-HA/PA6组植入体界面和表面完全被新骨组织覆盖(图4)。

　　3 讨论

　　理想的细胞外基质材料要求具备以下特性：适当的孔隙率、足够的强度和韧性、良好的成形加工性能以及良好的生物和物理相容性[5]。然而单一组分或单一结构的材料往往难以同时满足以上要求，这就需要将几种材料进行适当组合，综合其各自优势，合成有机/无机，羟磷灰石/多聚体等复合生物材料[6]，更好地实现对缺损骨组织的修复。本研究中选用的n-HA/PA6多孔复合物，就是一种以NaCl为致孔剂，采用粒子沥滤—相转移法制备, 由模拟自然骨的组成和结构的生物活性无机材料和有机高分子材料所形成的复合生物材料。n-HA微粒的直径在10~20 nm，以纳米尺度高比例均匀分布，可在40%～70%范围内调配，其大孔孔径分布在50~300 μm，平均孔径约为180 μm，且大孔壁上存在丰富的微孔，孔间相互贯通，支架孔隙率约为77%[7]，与传统的羟磷灰石陶瓷相比，具有更大的表面积，利于新生骨组织长入;而PA6分子中含有极性酰胺基团，分子末端分别是氨基和羧基，具有与骨组织胶原纤维相似的结构，与n-HA复合后能够形成类似人自然骨的晶体—胶原复合结构，具有高度的仿生性能，有利于种子细胞的黏附，同时具有较好的抗压性、耐磨性、耐热性。本研究中，首先培养出了符合骨组织工程种子细胞数量要求的高纯度的具有成骨细胞表型的BMSCs，进一步复合n-HA/PA6体外培养，发现BMSCs生长良好，细胞生长曲线和单纯培养BMSCs的生长曲线没有差别，ALP染色亦为阳性。结果提示：n-HA/PA6具有良好的细胞相容性，对BMSCs生长、增殖和骨向分化均不产生影响。在此基础上，本课题进行了整复SD大鼠颅骨极限缺损的实验研究：术后16周空白对照组颅骨标本仅有少量骨质从缺损边缘略向中间生长，仍有直径6 mm以上的缺损，而BMSCs复合n-HA/PA6与单纯n-HA/PA6多孔支架材料植入后，均无骨吸收、排斥现象，无骨髓炎、骨坏死发生，16周时植入体和原骨组织间的间隙完全消失，由新生骨组织充填，表明n-HA/PA6多孔仿生骨具有良好的组织相容性，其各级别的孔隙有利于血管、骨细胞的长入，从而诱导新骨生成。与n-HA/PA6组主要通过骨传导方式修复骨缺损不同，BMSCs复合n-HA/PA6组通过骨传导、骨诱导[8]2种方式修复骨缺损，由于种子细胞的介入，在4、8周时骨修复效果优势明显，新骨形成更早、更多、更成熟，不仅宿主骨与n-HA/PA6之间有新骨形成，n-HA/PA6内部也有新骨形成，进一步证实了n-HA/PA6多孔材料作为一种理想的细胞外基质材料构建组织工程骨的优势。因此，可以说以BMSCs为种子细胞、以n-HA/PA6为支架材料，构建组织工程化骨修复骨缺损，能够有效促进骨愈合进程，缩短骨愈合时间，本研究为未来骨组织工程技术的发展和进行骨缺损的修复提供了一定的实验依据。

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