牙龈卟啉菌蛋白酶rgpAcd基因表达载体的构建

　　作者：许静，李昂，苟建重，许援朝，饶国洲，刘 蒸，谢红帼　西安交通大学医学院附属口腔医院：1.口腔内科;　2.口腔医学研究中心，陕西西安 710004

　　摘要：目的 构建牙龈卟啉菌蛋白酶rgpA催化结构域(rgpAcd)基因的表达载体。方法 利用PCR技术和基因重组技术，克隆牙龈卟啉菌蛋白酶rgpAcd, 插入中介载体pMD18T中并测序鉴定。将目的基因片断插入原核表达载体pET15b，构建表达质粒pET15b/rgpAcd，通过限制性酶切鉴定。结果 PCR产物电泳结果显示，在大约1.5kb处有一特异的条带，与预期的大小一致，核酸序列测定与分析的结果表明，克隆的1476bp基因序列与GenBank数据库中的序列呈现100%同源性，未发生任何突变;构建的表达质粒经酶切后所得片断与预期大小一致，表明牙龈卟啉菌蛋白酶rgpAcd基因的表达载体构建成功。结论 成功克隆了牙龈卟啉菌rgpAcd基因并构建了表达载体，为进一步研制重组活载体疫苗奠定了基础。

　　关键词：牙龈卟啉菌;蛋白酶;表达载体

　　Construction of a recombinant expression vector of rgpAcd gene of porphyromonas gingivalisXu Jing, Li Ang, Gou Jianzhong, Xu Yuanchao, Rao Guozhou, Liu Zheng, Xie Hongguo

　　(1. Department of Oral Medicine, Affiliated Dental Hospital, Medical School of Xian Jiaotong University;

　　2. Research Center for Stomatology, Affiliated Dental Hospital,Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710004, China)

　　ABSTRACT: Objective To construct prokaryotic expression vector of the catalytic domain of rgpAcd of porphyromonas gingivalis (Pg). Methods The desired DNA fragment rgpAcd was obtained by PCR and was separately sequenced and identified by inserting into intervector pMD18T Vector. The correct fragment was linked with and cloned into an prokaryotic expression vector pET15b. Results A 1476bp specific fragment was obtained and DNA sequencing showed that the fragment was consistent with those of the published. After the recombinant expression plasmid was confirmed by enzymes digestion, it showed that the prokaryotic expression vector of rgpAcd gene was constructed successfully. Conclusion The protein of rgpAcd will be obtained for further study. Successful construction of live attenanated vaccine candidate plasmid lays solid foundation for future animal experiments and clinical trials.

　　KEY WORDS: porphyromonas gingivalis; gingipain; expression vector

　　牙周炎是口腔中的常见病和多发病。其引起的牙龈萎缩、牙槽骨丧失一般难以再生，目前治疗上尚无有效的方法。因此，牙周炎的早期预防至关重要。牙周炎是一种细菌感染性疾病，当牙周致病菌侵袭牙周组织时，人体会通过局部细胞免疫和全身免疫影响牙周炎的发生和发展，这就使牙周炎的免疫学预防和治疗成为可能。流行病学研究表明，革兰氏阴性厌氧菌牙龈卟啉菌(porphyromonas gingivalis, Pg)与牙周炎的发生、发展显著相关，是牙周炎的优势致病菌。

　　因此，研究设计针对Pg牙周炎疫苗，有可能对牙周炎的预防和治疗产生积极的影响。

　　近年来，牙周炎疫苗的研制和开发正日益受到关注。国外学者已在这方面进行了一些研究，发现以Pg蛋白酶免疫动物可以产生高水平的血清抗体，抵抗Pg的定植，并减轻由Pg引起的牙槽骨吸收。本实验旨在通过基因克隆和基因重组等技术获得Pg蛋白酶rgpA的催化结构域(gingipain rgpA catalytic domain, rgpAcd)基因并构建表达载体，为进一步研制重组活载体疫苗奠定了坚实的基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 菌株与载体 Pg ATCC 33277(四川大学华西口腔生物实验室)、大肠杆菌TOP10(北京天为时代科技有限公司)、中介载体pMD18T Vector(Takara)、原核表达载体pET15b

　　(Novagen)。

　　1.2 主要试剂 rTaq DNA Polymerase、限制性内切酶及DNA Marker DL2000、DNA Marker DL15000、Xgal和IPTG(Takara);DNA Marker Ⅵ、DNA Marker Ⅶ、细菌基因组 DNA 提取试剂盒、离心柱型质粒小提试剂盒和琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(北京天为时代科技有限公司)。

　　1.3 实验方法

　　1.3.1 细菌DNA的提取 Pg ATCC 33277用改良 GAM 培养基[1mg/L维生素K1、5%(体积分数)脱纤维蛋白羊血]，在37℃厌氧条件下(体积分数：80%N2，10%H2，10%CO2)培养5d，接种2-3个平皿，刮下细菌，离心收集菌体，-20℃保存备用。采用细菌基因组 DNA 提取试剂盒提取Pg DNA。获得的DNA采用紫外吸收法作定量和纯度检测。

　　1.3.2 PCR扩增特异性基因片断 以Pg基因组DNA为模板，根据Pavloff等报道的Pg rgpA基因序列(GI：557067)，设计rgpAcd引物，上游包含NdeⅠ酶切位点和起始密码子ATG，下游包含终止密码子TGA。上游引物的序列 为5′CATATGTACACACCGGTAGAGG3′(22bp)，下游引物的序列为5′TCAGCGAAGAAGTTCGGGGGCA3′(22bp)。由上海生工生物工程技术公司合成。用rTaq酶扩增rgpAcd基因，PCR反应体系为50μL。反应条件：94℃预变性5min，进入热循环――94℃变性30s，55℃复性1min，72℃延伸2min 30s。共35个循环后，再72℃延伸20min。将PCR产物进行10g/L琼脂糖凝胶电泳分析。

　　1.3.3 PCR产物的克隆和重组质粒的鉴定 PCR产物用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收，与pMD18T Vector连接进行T/A克隆，以连接产物转化E.coli TOP10感受态细胞，涂碟，进行Xgal/IPTG蓝白斑筛选。挑选白色克隆，摇菌，用离心柱型质粒小提试剂盒提取质粒，用BamHⅠ和SalⅠ双酶切鉴定。酶切正确的阳性克隆送上海生工生物工程技术公司测序。正确的重组质粒命名为pMD18T/rgpAcd。

　　1.3.4 原核表达质粒pET15b/rgpAcd的构建和鉴定 分别将已构建并经测序鉴定的pMD18T/rgpAcd用BamHⅠ/SalⅠ双酶切，原核表达载体pET15b 用BamHⅠ/XhoⅠ双酶切，低熔点胶回收酶切片段后，以T4连接酶连接，转化至E.coli TOP10感受态细胞中，对阳性菌落进行酶切鉴定。正确的原核表达质粒命名为pET15b/rgpAcd。

　　2 结 果

　　2.1 Pg ATCC 33277 DNA的定量及纯度 经紫外吸收法测定，A260/A280 =1.76，说明DNA纯度较高，基本没有RNA及蛋白污染。DNA质量浓度为68mg/L。电泳结果显示所获得DNA纯度较高，且DNA链大于15kb(图1)。图1 Pg基因组DNA电泳图(略)

　　2.2 PCR产物的获得 PCR产物电泳，在大约1.5kb处有一特异的条带，与预期的大小(1476bp)一致(图2)。图2 PCR产物电泳图(略)

　　2.3 重组质粒的鉴定 以TA法将PCR产物克隆至中介载体pMD18T中，重组质粒pMD18TrgpAcd经BamHⅠ和SalⅠ双酶切，与预期相符(图3)。测序结果同GenBank中收录的序列完全一致，未发生任何突变。图3 pMD18T/rgpAcd重组质粒BamHⅠ/SalⅠ双酶切图(略)

　　2.4 表达质粒的构建与鉴定 重组质粒pMD18TrgpAcd用BamHⅠ和SalⅠ双酶切出所需片段，定向插入经BamHⅠ/XhoⅠ双酶切的原核表达载体pET15b中，构建表达质粒pET15b/rgpAcd，该重组质粒经NdeⅠ酶切后，与预期大小一致(图4)，表明成功构建表达质粒。图4 pET15b/ rgpAcd表达质粒NdeⅠ酶切图(略)

　　3 讨 论

　　目前有关牙周炎的免疫学研究主要包括主动免疫和被动免疫两个方面，被动免疫疗效维持时间短又需要长期反复应用，而采用主动免疫则变得简单。主动免疫疫苗又分为灭活疫苗及亚单位疫苗、多肽疫苗、基因疫苗、重组活载体疫苗等，这些疫苗已用于动物实验，并获得了一定的成功。Pg是慢性牙周炎中最主要的优势菌群，是目前公认的牙周炎病原菌。但是Pg全菌细胞抗原成分较多，免疫后易与人体组织产生交叉免疫反应，有引起自身免疫性疾病的危险。因此，提取Pg中具有能诱导免疫保护作用的特异抗原，可提高免疫保护的效果，减少不良反应的发生。寻找一种合适抗原是牙周炎疫苗研究的首要步骤，也是目前国内外学者研究的重点。

　　Pg表面具有一系列逃避宿主防御机制及破坏宿主组织的毒性因子，如脂多糖、菌毛、外膜蛋白、血凝素和蛋白酶等，其中蛋白酶(gingipain)在Pg致牙周病作用中占有重要地位。蛋白酶是一类结构和功能十分相似的蛋白质，具有多种生物学活性，在细菌粘附中起重要作用，并具有很好的免疫原性，可诱导机体的保护性免疫应答，被认为是很有潜力的牙周炎疫苗抗原。国际生化联合会( International Union of Biochemistry) 将其分为两类：一为蛋白酶R(RGP)，作用于底物后只在精氨酸位置水解蛋白质，故以前也称为精氨酸特异性蛋白酶;二为蛋白酶K(KGP)，作用于底物后只在赖氨酸位置水解蛋白质，故以前也称为赖氨酸特异性蛋白酶。RGP和KGP属于半胱氨酸蛋白酶，归属梭菌蛋白酶家族。研究表明，通过严格的纯化和基因分析可得到3种主要的Pg蛋白酶，即rgpA、rgpB和kgp。其中rgpA不仅影响细菌的定植和生长，而且侵袭和破坏宿主组织，影响免疫反应和血管系统，导致牙周炎具有其临床症状;同时rgpA具有很好的免疫原性，可诱导机体的保护性免疫应答。因此，针对蛋白酶rgpA设计的牙周炎疫苗将成为防治牙周病的重要手段。近年来，随着分子生物学的发展，国内外学者已在RGP的遗传学方面做了大量的研究工作，对其基因、蛋白结构，结构与功能的关系有了更深入的了解。1995年Pavloff 等首次克隆了Pg H66和W50的rgpA基因全长，由6.3kb组成，包括全部编码区和5'3'非编码区，开放读框包括5112个核苷酸，编码1704个氨基酸的蛋白。在核苷酸nt 889-894位点上存在TATA盒，nt949-951位点上有ATG启动密码子，后接一信号序列。其中前277个氨基酸是前肽部分，包括信号肽和N端前序列;228-720氨基酸为成熟肽蛋白酶结构域即rgpAcd，721-1704氨基酸为血凝集素结构域。其中rgpAcd为RGP的生物活性部分，包括492个氨基酸。本实验根据已发表的Pg rgpA序列设计引物，采用PCR方法从Pg ATCC 33277 DNA中扩增出rgpAcd的基因片断，克隆到中介载体pMD18T Vector中并测序鉴定。将目的基因片断插入原核表达载体pET15b，构建了表达质粒pET15b/rgpAcd，为进一步研制重组活载体疫苗奠定了坚实的基础。

　　本实验所用的pET15b 载体属于T7 RNA 聚合酶/启动子表达系统。该表达系统有一个特点，就是需用不同的宿主菌进行外源基因的克隆和表达，在外源基因表达产物是宿主菌的毒蛋白时，在同一宿主菌进行克隆和表达会很困难，有时是不可能的。因此在本实验中，用于克隆的宿主菌TOP10不表达T7RNA聚合酶，宿主菌的其他RNA聚合酶不识别T7RNA启动子，rgpAcd基因得不到表达，不会对宿主菌造成影响，从而保证rgpAcd基因的克隆顺利进行。在完成rgpAcd基因的克隆后，再将重组质粒pET15b/rgpAcd转化可以表达T7 RNA 聚合酶的宿主菌，在IPTG的诱导下，启动T7启动子控制的rgpAcd基因，表达rgpAcd蛋白。此外，pET15b载体表达的融合蛋白含有6×HisTag，可以被特异吸附His的镍金属螯合柱纯化或通过组氨酸琼脂糖珠进行纯化。这为今后体外表达并纯化其活性蛋白，进一步研制重组活载体疫苗提供了可能。

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