动脉化疗前后MMP9、TIMP1在口腔鳞癌组织中的表达

　　作者：李雅冬, 张劲松, 杨 凯, 张福军, 陈 睿, 邓 丹 作者单位：(重庆医科大学附属第一医院 口腔科,重庆 400016)

　　【摘要】 目的： 研究MMP9、TIMP1在化疗前后口腔鳞癌组织中的表达，探讨口腔鳞癌的侵袭机制。方法: 应用免疫组织化学SP法检测化疗前后MMP9 和TIMP1在口腔鳞癌组织中的表达，分析不同临床分期、组织学分级、淋巴结有无转移间的MMP9及TIMP1表达是否存在差异，结合临床病理资料和基因蛋白表达特征作差异显著性检验及相关分析。结果: 化疗前口腔鳞癌MMP9表达高于化疗后，MMP9表达与临床分期，淋巴转移和疗效有关,与组织学分级，性别和年龄无关;化疗前后TIMP1表达无差异，TIMP1表达与临床分期，淋巴转移和疗效有关，与分级，性别和年龄无关;MMP9与TIMP1阳性率密切负相关(r=-0.543 68,P<0.05)，化疗前后MMP9和TIMP1与疗效之间密切负相关(r=-0.609 47,P<0.05)。结论: MMP9及其抑制因子TIMP1在口腔鳞癌的进展过程发挥重要作用，综合分析上述基因蛋白表达特征和口腔鳞癌的临床-病理特点可较好地指导治疗。

　　【关键词】 口腔肿瘤; 癌，鳞状细胞; 基质金属蛋白; 金属蛋白酶1组织抑制剂; 化学栓塞，治疗性

　　Expression of MMP9 and TIMP1 in Oral Squamous Cell Carcinoma

　　before and after Received Intraarterial Chemotherapy

　　LI Yadong, ZHANG Jinsong, YANG Kai, ZHANG Fujun, CHEN Rui, DENG Dan

　　(Department of Stomatology, The First Affiliated Hospital，Chongqing

　　University of Medical Science, Chongqing, 400016, China)

　　[Abstract] Objective: To investigate the expression of MMP9 and TIMP1 in oral squamous cell carcinoma (OSCC) before and after intraarterial chemotherapy (IC), and to explore the invasive behavior, mechanism, and prognosis of OSCC. Methods: Specimens of 20 OSCC patients before and after IC were examined by using SP immunohistochemistry method. The expression characteristics of MMP9 and TIMP1, and clinical and pathological features were determined and differences were analyzed. Results: MMP9 expression in OSCC was higher before IC than after, and significantly related with clinical stages, lymph node metastasis, and curative effect, but not with histological grades, or sex and age of patients; TIMP1 expression before IC did not differ from that after. There were significant correlations of TIMP1 expression in OSCC with clinic stages, lymph node metastasis, and curative effect, but not with histological grades, or sex and age of patients; A significantly negative correlation was observed between MMP9 positive stainning and TIMP1 positive staining (r=-0.54368, P<0.05), and there was a closely negative correlation between MMP9 and TIMP1expression with curitive effects of IC (r=-0.60947, P<0.05). Conclusions: MMP9 and its inhibitory factor TIMP1 may play a key role in progress of OSCC. Analysis of the expression characteristics of MMP9 and TIMP1 and clinical and pathological features of OSCC may better conduct clinical therapy of OSCC.

　　[Key words] mouth neoplasms; carcinoma, squamous cell; matrix metalloproteinases; tissueinhibitor of metalloproteinase1; chemoembolization, therapeutic

　　癌细胞的侵袭和转移是一个多阶段、多步骤、多因素及多基因参与的极其复杂的病理过程。Liotta等曾经提出肿瘤细胞的浸润三步学说，认为基质金属蛋白酶-9(MMP9)和组织金属蛋白酶抑制子-1(TIMP1)是一对调节细胞外基质降解、影响细胞侵袭能力的拮抗子，前者能降解细胞外基质，促进肿瘤细胞的侵袭和转移，而后者能抑制MMP9的活性，在肿瘤的侵袭转移中起负性调节作用 。因此，MMPs-TIMPs平衡是维持细胞外基质内环境和完整性，阻碍癌细胞侵袭和转移的决定因素。口腔鳞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是头颈部最常见的恶性肿瘤，占口腔癌的首位[1]，恶性程度高、侵袭能力强、转移快，化疗仍是治疗口腔颌面部鳞状细胞癌的主要手段之一，但尚无研究表明化疗对MMP9及TIMP1的表达有影响。对2001-2008年20例口腔鳞癌手术标本进行研究，检测MMP9及TIMP1基因蛋白在化疗前后的口腔鳞状细胞癌中的表达，探讨口腔鳞癌分化和发展相关因素。

　　1 材料与方法

　　1.1 临床资料及标本 181例口腔癌患者的手术标本中，抽取20例口腔鳞癌患者均具有完整的临床资料，男性14例，女性6例，平均(55.5±10.6)岁，瘤体均被全切。疗效分为：有效(有效指经过卡铂、5Fu动脉化疗后，原发灶缩小)和无效(原发灶无变化或增大)。肿瘤部位分：颊癌7 例、口底癌5例、舌癌5例、上腭癌2例、牙龈癌1例;按1997 年WHO 口腔鳞癌的组织学标准进行分类,高分化鳞癌7 例,伴颈部淋巴结转移1例;中分化鳞癌9 例,伴颈部淋巴结转移7 例;低分化鳞癌4 例,伴颈部淋巴结转移2 例。按2002年UICC 口腔鳞癌临床分期，Ⅱ期 7 例，Ⅲ期11 例，Ⅳ期2例。所有患者经颞浅动脉埋泵行卡铂、5FU联合化疗1～4个疗程后，行口腔癌根治手术，化疗前、后标本分别进行HE染色和免疫组织化学染色。

　　1.2 主要实验仪器及试剂 奥林巴斯生物显微镜 (BHS型，日本)，病理组织包埋机 (BMZIII型，国产)，兔抗人MMP9多克隆抗体(产品编号ZA0336)，兔抗人TIMP1多克隆抗体(产品编号ZA0429)。美国ZYMED公司SP系列试剂盒：过氧化物酶标记的链霉卵白素(Streptavidin/Peroxidase)染色试剂盒，DAB显色剂(浓缩型试剂盒，ZLI9032，北京中杉金桥生物技术有限公司)。

　　1.3 免疫组织化学检测 将标本切片、脱蜡、水化、冲洗，顺次滴加免疫组化试剂，封片。参照IRS(immunoreactive score)半定量法[2]判定MMP9和TIMP1阳性表达结果。并设置阴性对照：将I抗用PBS液替代，其余步骤相同。设置阳性对照：阳性对照片为已知口腔鳞癌阳性片。在排除非特异性染色前提下，阳性表达以细胞膜和(或)细胞浆内出现棕黄色颗粒为准。

　　1.4 统计学处理 采用SAS 8.1统计软件进行配对符号秩和检验、Spearman等级相关分析。P<0.05为具有统计学意义。

　　2 结果

　　20例口腔鳞癌患者临床分期、病理分级、治疗效果及治疗前后MMP9、TIMP1表达情况见表1。

　　2.1 MMP9表达 MMP9在口腔鳞癌组织中的表达主要以肿瘤细胞细胞浆表达为主，亦可见于部分间质内，尤以癌巢的边缘实质细胞内多见，可呈散在分布(图1)。20例口腔鳞癌中化疗前MMP9阳性17例 (85%)，临床分期在III、IV期的13例患者中有12例MMP9呈阳性表达(92.3%)， 高于临床分期在II期的患者(71.4%)，r=0.520 72，P<0.05;有淋巴结转移10例患者的MMP9均呈阳性表达(100%)，高于无淋巴结转移的患者(70%)，r=0.717 49，P<0.05;化疗有效的14例患者MMP9阳性表达11例(78.6%)，低于化疗无效的患者(100%)，r=-0.504 73，P<0.05;MMP9表达与年龄、性别、病理分级无明显关系(P>0.05)。20例口腔鳞癌化疗后，MMP9阳性10例(50%)，低于化疗前(P<0.05)。

　　2.2 TIMP1的表达 TIMP1在口腔鳞癌组织中阳性表达见于肿瘤细胞胞浆(图2)。化疗前：20表1 20例口腔鳞癌患者病理分级、临床分期、疗效及MMP9、TIMP1表达注：“病例”项下数字为病例序号，a、b为手术前、后;病理分级： I为高分化，II为中分化，III为低分化;淋巴结：术后病理标本，分母为标本中淋巴结数目，分子为有肿瘤转移的淋巴结数目;MMP9、TIMP1表达：弱阳性(+)、 中阳性(++)、 强阳性(+++);疗效：化疗后，有效为1，无效为0;MMP9 &TIMP1:MMP9低于TIMP1为(-)、MMP9与TIMP1相同为(±)、MMP9高于TIMP1为(+)。

　　图1 MMP9在口腔鳞癌中的表达(SP，×200)

　　Fig.1 Expression of MMP9 in OSCC section, ×200图2 TIMP1在口腔鳞癌中的表达(SP，×200)

　　Fig.2 Expression of TIMP1 in OSCC section, ×200例口腔鳞癌TIMP1阳性16例(80%)，临床分期在III、IV期的13例患者有9例TIMP1呈阳性表达(69.2%)， 低于临床分期在II期的患者(71.4%)，r=-0.461 61，P<0.05;有淋巴结转移的10例患者有6例TIMP1呈阳性表达(60%)，低于无淋巴结转移的患者(100%)，r=-0.486 66，P<0.05;化疗有效的14例患者均表达TIMP1，高于化疗无效的患者(33.3%)，r=0.991 19，P<0.05。 TIMP1表达与年龄、性别、病理分级无明显关系(P>0.05)。化疗后20例口腔鳞癌TIMP1阳性16例(80%)，与化疗前相同。

　　2.3 各指标间的相互关系 在化疗无效组中，化疗前MMP9表达阳性为11例，TIMP1阳性表达为6例，两者比率83.3%，高于化疗有效组(P<0.05)。

　　2.4 MMP9和TIMP1的相关关系 MMP9与TIMP1，基因蛋白表达存在负相关关系(P<0.05)。

　　3 讨论

　　细胞外基质(ECM)成分的降解是肿瘤浸润的关键步骤，MMPs是调节ECM降解动态平衡的最重要的酶系，对ECM具有广泛的降解作用。MMP9是基质金属蛋白酶家族成员之一，可降解细胞外多种基质成分，尤其是基底膜的主要成分Ⅳ胶原，溶解破坏基底膜，为肿瘤的侵袭性生长开辟道路[3]。此外，MMP9的分泌可导致内皮细胞穿破基质，促进肿瘤新生毛细血管的生长[4]。研究证实，MMP9在胃癌[5]、直肠癌[6]、肺腺癌[7]、骨巨细胞瘤[8]、甲状腺乳头状癌[9]、胰腺癌[10]、食管鳞癌[11]及肺癌[12]中均有表达，并对肿瘤的浸润、转移有促进作用，可作为判断预后的重要指标[13～15]。本研究结果表明，MMP9阳性表达主要见于肿瘤细胞，少部分位于毛细血管内皮细胞，推测MMP9的表达上调可能参与了口腔鳞癌的侵袭过程，促进了侵袭的进展。

　　口腔鳞癌具有较高的侵袭性和淋巴结转移能力，早期诊断和治疗具有重要的意义。实验中发现，MMP9与临床分期及淋巴结转移有关，提MMP9与口腔鳞癌的侵袭和淋巴结转移密切相关，且呈正相关，肿瘤细胞阳性表达MMP9有利于肿瘤细胞的脱落转移，促进了肿瘤细胞转移的发生，MMP9可能是口腔鳞癌淋巴结转移的危险因素。在本实验中，部分肿瘤组织并不表达MMP9，而有表达的肿瘤细胞也是呈散在、片状、灶状分布，多位于癌巢边缘，提示具有转移潜能的肿瘤细胞多位于肿瘤病灶周边，有利于肿瘤细胞向周围浸润或向远处转移。实验结果显示TIMP1与临床分期及淋巴结转移有关，具有抑制肿瘤转移的作用。实验结果表明MMP9表达上调导致了MMP9和TIMP1的表达失衡，无足够的TIMP去抑制MMP活性，则MMP活性被激活[16]，降解ECM使促瘤细胞突破基底膜而向外扩散，甚至通过血液及淋巴造成远处转移。

　　20世纪40年代，化学治疗开始进入肿瘤治疗领域，五六十年代开始用于头颈部恶性肿瘤的治疗。随着多种有效抗癌药物的出现，化疗已作为头颈癌综合治疗的手段之一。区域性动脉灌注化疗是近年来肿瘤化疗方面又一新进展，它可使抗癌药物在肿瘤细胞周围形成有效的高浓度，最大限度地杀死肿瘤细胞，而不显现抗癌药物较大的毒副作用，目前最经济有效的化疗方案是5Fu联合卡铂[17]。本试验结果表明，5Fu联合卡铂区域性动脉灌注化疗改变了MMP9在口腔鳞状细胞癌组织中的表达，化疗前口腔鳞癌MMP9阳性表达高于化疗后MMP9阳性表达，有显著性差异，表明5Fu联合卡铂区域性动脉灌注化疗对MMP9有抑制作用，从而抑制口腔鳞状细胞癌的发展和转移。行动脉化疗两周后，若还能检查到肿瘤包块，则可行手术治疗，以防止转移，达到根治的目的。

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