脑神经嵴干细胞体外培养方法的研究进展

作者：杨蓉综述 江宏兵审校    作者单位：南京医科大学附属口腔医院口腔颌面外科 江苏 南京 210029 【摘要】  脊椎动物的脑神经嵴干细胞（CNCSC）具有多向分化潜能，参与形成颅颌面部多种组织器官。下文就近年来CNCSC体外分离培养技术作一综述，为研究CNCSC与口腔颌面部组织器官发育、再生修复以及相关疾病发生机制提供方法学参考。

【关键词】  脑神经嵴； 干细胞； 体外培养

    Recent advances in cultured approaches of cranial neural crest stem cells  YANG Rong, JIANG Hong-bing. （Dept. of Oral and Maxillofacial Surgery, College of Stomatology, Nanjing Medical University, Nanjing 210029, China）

    [Abstract]  The vertebrate cranial neural crest is a pluripotent stem cell population, giving rise to various types of tissues in the craniofacial region. This article is to review the research progress of in vitro culture approaches of cranial neural crest stem cells, to provide methodological reference for study on craniofacial development, regeneration, and associated diseases.

    [Key words]  cranial neural crest； stem cell； in vitro culture

    脑神经嵴干细胞（cranial neural crest stem cell，CNCSC）不仅存在于移行中的神经嵴，也存在于自胚胎迁移的目标组织中，故获取CNCSC主要根据其分布和迁移目标进行分离培养[1-5]。建立CNCSC体外培养模型，对于研究颅颌面组织器官发育、再生修复以及相关疾病发生机制有重要的意义。

    1  建立CNCSC体外培养模型的意义

    CNCSC为脊椎动物所特有的一类细胞，发生于外胚层毗邻的神经嵴部，在胚胎发育中，它是一组特殊的多潜能干细胞群，广泛迁移分布于机体的各种组织器官之中，可分化为神经元、神经胶质细胞、内分泌细胞、皮肤色素细胞和颅颌面部外胚间充质细胞等。CNCSC是机体内多性能的结构之一，将不同胚层衍生的组织器官联系了起来，不仅是研究不同胚层转化机制的理想细胞学工具，而且对认识其相关疾病的发生机制具有重要意义[6-7]。

    口腔颌面部的大部分组织，譬如牙本质、牙骨质、牙周膜、颌骨、神经等等组织主要来源于CNCSC，因此，CNCSC成为研究口腔颌面部组织发生的重要目标。以CNCSC作为种子细胞尝试组织器官的再生修复，更是组织工程学的研究热点，而体外获取CNCSC是这些研究的基础[6，8]。

    2  胚胎期获取CNCSC的培养方法

    2.1  脑神经管组织块法分离培养迁移前CNCSC

    神经管组织块法是经典的CNCSC取材方式。取第8.5天的孕鼠，去除子宫、胎盘、卵黄囊、羊膜等组织并取出胚胎，放入含有汉克平衡盐的培养皿中，切取第6体节之前的颅段神经管，用新鲜的平衡盐液漂洗。用质量浓度2.5 g/L的胰酶或0.75 g/L的胶原酶消化。用吸管轻轻吹打组织，使头颅部的神经管与其他组织游离。吹打时动作务必轻柔，因为此时的胚胎组织结构疏松，稍一用力，就有可能将胚胎组织吹散，得不到完整的神经管。将神经管移至表面含有纤连蛋白（fibrone-ctin，FN）涂层的培养皿中，附着15～30 min后加入无血清培养液。培养48 h后剔除神经管，CNCSC在2 d内即从组织块周围游出来，形态以梭形为主。该细胞呈现克隆样生长，具有自我更新能力和多向分化等干细胞的生物学特征[9]。

    利用CNCSC的迁移性及其与FN的亲和性，用涂有FN的培养皿将CNCSC自神经管中分离出来。由于血清可促进CNC的分化，故目前的培养液中多为达尔贝科极限必需培养液（Dulbecco min-imum essential medium，DMEM）/F-12无血清培养液，根据不同的研究条件选择性添加相关辅助成分，如鸡胚提取物、转铁蛋白、胰岛素、孕酮、腐胺、地塞米松、油酸甘油酯、牛血清白蛋白、生物素、甘油、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子、神经生长因子、干细胞因子、亚硒酸、甲碘胺、黑色素细胞刺激素、地诺前列酮、维生素、羟基丁酸、维A酸和氯化钴等[9-10]。

    2.2  颌突酶消化法分离培养迁移后CNCSC

    CNCSC随鳃弓发育迁移至颌突并增殖分化为外胚间充质。Zhao等[4]以颌突取材建立了稳定的CNCSC培养系统，在比较了5种CNCSC培养方案后优选出化学物质修饰无血清培养液，其成分有低糖DMEM、质量分数10%的鸡胚提取物、质量浓度20 μg/L的碱性成纤维细胞生长因子、N2、维生素B27、维A酸等。取9.5～12.5 d的小鼠胚胎，汉克液冲洗并分离出其中的颌突，在37 ℃温度下用含质量分数0.1%胶原酶和0.025%胰酶的无钙和镁离子的胶原酶混合物对其消化4 min，吹打分散细胞成单细胞悬液并将其置于FN包被的培养皿中培养2 d，以p75为标记或利用转基因技术显示CNCSC，使用荧光激活细胞分选术对CNCSC进行分选纯化，最后通过免疫细胞化学给予鉴定。结果CNCSC的标记物人类自然杀伤细胞-1、巢蛋白均为阳性，CNCSC可诱导分化为神经膜细胞、成肌细胞、成骨细胞和成牙本质细胞等，显示其多向分化能力。Lin等[11]用类似方法获取了CNCSC源的外胚间充质细胞，在常规含血清培养液中加入白血病抑制因子，有效地抑制了干细胞的自发性分化速度，利于其作为细胞模型研究相关细胞谱系的分化机制。

    2.3  胚胎干细胞体外诱导分化为CNCSC

    从体外培养的胚胎干细胞中诱导分化并纯化CNCSC，有助于对此类细胞的发育过程有更好的了解。主要方法是将胚胎干细胞和ST2基质细胞株在一定条件下共培养，可得到接近体内CNCSC样的多分化潜能细胞，而ST2基质细胞株为干细胞提供了适宜的生长环境。预先将ST2基质细胞株接种培养于六孔板中，取500～1 500个胚胎干细胞接种至六孔板，使用α-极限必需培养液并加入质量分数10%的胎牛血清（fetal bovine serum，FBS），浓度为1×10－7 mol/L地塞米松、20 pmol/L的成纤维细胞生长因子-2、10 pmol/L的霍乱毒素、100 nmol/L的全反维A酸以及质量浓度为100 μg/L的人重组内皮素-3，37 ℃条件下培养，每2 d换1次液。培养9～12 d后将其置于中性蛋白酶Ⅱ中消化，用浓度0.01 mol/L的磷酸缓冲盐溶液和质量分数3%的FBS配成的染色培养液清洗重悬，以c-Kit作为细胞标记物，以CD45作为排除造血系细胞来源的标记物，用抗c-Kit和抗CD45的抗体标记培养细胞。为提高检出敏感度，选用与别藻蓝蛋白结合的抗体，用流式细胞仪分选出c-Kit阳性和（或）CD45阴性的细胞。

    免疫细胞化学、反转录聚合酶链反应和卵内接种试验证实，该类c-Kit阳性和（或）CD45阴性的细胞可形成包含神经元、神经胶质细胞和黑素细胞等多种神经嵴源性的细胞克隆，卵内接种的细胞可沿神经嵴迁移路径迁移。此外，还检测到甲平滑肌抗原阳性细胞，但数量较少。在这一培养系统之中，由胚胎干细胞分化而来的c-Kit阳性和（或）CD45阴性细胞非常接近体内的CNCSC[12-13]。

    3  成体后获取CNCSC的培养方法

    3.1  毛囊区CNCSC的培养

    就再生医学的临床应用来说，在成体上寻找适宜的干细胞更具有治疗与现实意义。储存于毛囊膨隆部的CNCSC不但可循环再生毛发生长初期的毛球，还可再生皮脂腺和表皮组织。在紧邻毛囊的表皮有黑素干细胞、巢蛋白阳性细胞、间充质细胞以及一些未明确的干细胞群[14]。毛囊区CNCSC容易获取、取材方便、损伤小，不涉及免疫原性和伦理道德问题，可作为理想的CNCSC来源。

    取小鼠触须垫，缓冲液冲洗数次后于体视显微镜下解剖出单个毛囊，去除疏松的真皮组织并剖开外根鞘，在毛囊膨隆部上下横断并取出毛囊膨隆部，将其置于35 mm厚胶原包被的培养皿中预培养30～90 min，待组织块黏附后加入1.5 mL培养液。48～72 h后毛囊CNCSC开始移行出组织块，4～6 d后取出组织块，胰酶消化重悬细胞，以1×104个/35 mm细胞的密度将其置于胶原包被的35 mm培养皿中传代培养[15]。培养液的主要成分为DMEM/F-12、维生素B27和碱性成纤维细胞生长因子等[16]。

    利用神经嵴特征性标记物分选目标细胞，极大地提高了细胞的获取效率。首先，大量培养皮肤表皮细胞，再用荧光标记的特异性抗体与CNCSC特异性蛋白结合，随后通过荧光激活细胞分类技术将其从表皮细胞悬液中分离出来。常用的标记物有巢蛋白、p75和sox-10等[17-18]。由于对CNCSC特征性蛋白的研究尚处于探索阶段，所以这种方法取得的细胞纯度有待继续深入的研究。

    将提取出的毛囊CNCSC与诱导性上皮相结合，植入免疫缺陷小鼠后可产生毛囊。这为脱发这一临床难题提供了新的治疗途径。毛囊CNCSC还可为其他神经嵴源性组织的再生修复提供种子细胞。有学者利用其进行外周神经系统、造血系统的再生研究，亦取得了令人鼓舞的成果[19-20]。

    3.2  角膜区CNCSC的培养

    成体角膜中具有神经嵴来源的多能干细胞，表达CNCSC标记物巢蛋白，可被诱导分化为脂肪细胞和软骨细胞等。取材时，用刀片沿角膜缘外侧环形切下角膜，去除虹膜、睫状体和内皮组织，保留上皮基质，将其置于质量浓度为5 g/L的中性蛋白酶Ⅱ中4 ℃过夜。去除疏松表皮层，将角膜基质盘切成小块，用质量分数为0.05%的胰酶于37 ℃下消化30 min，随后在7.8×104 U/L的胶原酶和3.8×104 U/L的玻璃酸酶中处理30 min。将基质细胞机械分离为单细胞悬液，在加有质量浓度20 μg/L的表皮生长因子、10 μg/L的成纤维细胞生长因子-2和维生素B27等添加物的DMEM/F-12中培养，培养密度为1×108个/L细胞，培养7 d后可见细胞球形成，每7～14 d传代1次。角膜区CNCSC不仅表达巢蛋白，还表达胚胎期神经嵴标记物扭曲蛋白（Twist）、蜗牛蛋白（Snail）、蛞蝓蛋白（Slug）和Sox-9等。在单克隆培养和体外分化试验中的不同诱导条件下，角膜区CNCSC表现出多种细胞分化潜力[5，21]。

    Li等[22]通过类似的方法分离培养坐骨神经节获得了CNCSC，即除毛囊和角膜等成体组织外，神经节也可能储存有CNCSC。但是否可以从颅神经节中获取CNCSC，至今尚未见报道，有待进一步研究。

    4  结语

    CNCSC与颅颌面部发生关系密切，建立稳定的CNCSC体外培养系统，是研究颅颌面部组织器官发育、再生修复以及相关疾病发生机制的重要方法。利用成体组织中储备的CNCSC建立稳定的体外培养体系，寻找组织定向分化诱导条件，将对颅颌面部组织的再生修复具有广阔的应用前景。

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