变异链球菌蛋白质提取方法研究

变异链球菌蛋白质提取方法研究作者：何永红 田晓蓓 万呼春 温艳丽 张菲菲 马琴睿    作者单位：1.口腔疾病研究国家重点实验室，四川大学；2.四川大学华西口腔医院 综合治疗科，四川 成都 610041    【摘要】  目的  建立稳定、有效的提取变异链球菌蛋白质方法。方法 以裂解液为提取介质，分别采用反复冻融超声、超声、热裂解和热裂解超声4种方法提取细菌蛋白质，通过分析细菌破碎程度、蛋白质SDS-PAGE电泳及蛋白质质量浓度，比较各提取方法的效果。结果 除热裂解法外，其他3种方法均可有效裂解细菌，其中超声起主要作用，同时这3种方法提取蛋白质的SDS-PAGE条带分布基本相同，但反复冻融超声法提取蛋白质条带丰度最高。蛋白质质量浓度测定显示，反复冻融超声法提取蛋白质质量浓度最高。4种方法均具有较好的稳定性和重复性。结论 反复冻融超声法可以有效提取变异链球菌蛋白质，有较好的稳定性和重复性，且操作简单。   【关键词】  变异链球菌 蛋白质组 超声　　Study on protein extraction methods for Streptococcus mutans  HE Yong-hong1, TIAN Xiao-bei1, WAN Hu-chun2, WEN Yan-li2, ZHANG Fei-fei2, MA Qin-rui2. （1. State Key Laboratory of Oral Diseases, Sichuan University, Chengdu 610041, China; 2. Dept. of General Treatment, West China College of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, China）　　[Abstract]  Objective  To establish an efficient and stable method for protein extraction of Streptococcus mutans.Methods  The collected bacteria were treated by freeze-thaw and ultrasonic（method 1）, ultrasonic（method 2）, boiling （method 3）, boiling and ultrasonic（method 4）, respectively. The index such as state of bacteria broken, concentration of extracted protein and SDS-PAGE of protein were employed to evaluate the effects of above four methods. Results Beside the method 3, the other three methods could break the bacteria effectively, of which ultrasonic was the key factor. The pattern of SDS-PAGE which treated by method 1, method 2 and method 4 was almost same, but method 1 resulted in the best abundance. There was significantly difference among the four protein concentration extracted by four methods（P<0.05）. All methods exhibited good stability and reproducibility. Conclusion  Method of freeze-thawand ultrasonic resulted in an efficient proteins extraction of Streptococcus mutans which demonstrated good stability and reproducibility and easy to handle. 　 [Key words]  Streptococcus mutans； proteomics； ultrasonic　　目前国内外对变异链球菌（简称变链菌）（Strep-tococcus mutans，S.mutans）的研究已经进展到蛋白质组水平[1-6]，蛋白质组研究的第一步是对研究对象的蛋白质进行最大程度的提取，因此对细菌蛋白质进行有效提取是变链菌蛋白质组研究的关键步骤。目前文献报道的提取方法主要有反复冻融、超声裂解和热裂解法[1-5]。本研究在参考国内外文献基础上，对变链菌蛋白质提取方法进行比较研究，以期探索一种稳定有效的提取方法，为该菌后期的蛋白质组研究奠定基础。1  材料和方法　　1.1  主要材料和仪器　　变异链球菌ATCC 25175（四川大学口腔疾病研究国家重点实验室提供）。TPY培养基, 裂解液（30 mmol/L Tris-HCl，0.3％SDS，1.0％DTT，pH=8.0），BCA蛋白定量试剂盒（Pierce公司，美国）。 RC DC蛋白定量试剂盒（BIO-RAD公司，美国），超声破碎仪（Sanyo公司，日本），微型垂直电泳系统和BIO-RAD 2000凝胶成像分析系统（BIO-RAD公司，美国）。　　1.2  细菌培养及收集　　细菌复苏后接种TPY琼脂平板，37 ℃厌氧（80%N2，10%H2，10%CO2）培养24 h，挑取单菌落接种TPY液体培养基，37 ℃厌氧培养24 h，收集菌悬液，4 ℃ 12 000 g离心10 min，细菌沉淀重悬于含氯霉素（100 mg/L）的生理盐水中，调整菌密度为每毫升1×1010个，按每管1 mL分装离心管中，4 ℃ 12 000 g离心10 min, 沉淀于-20 ℃保存备用。　　1.3  细菌蛋白质提取　　1.3.1  方法1（反复冻融超声法）  将细菌沉淀反复冻融3次（20 ℃ 5 min，-20 ℃ 30 min），加入1 mL裂解液，超声（11 kHz，10 s×84个循环，间隔1 min，冰浴），振荡（5×30 s，间隔1 min，冰浴）。然后取10 μL悬液涂片进行革兰染色，剩余悬液4 ℃ 16 060 g离心10 min，上清液中取300 μL进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）；200 μL测定蛋白质质量浓度；400 μL加入4倍体积预冷丙酮，-20 ℃过夜，4 ℃ 15 100 g离心10 min，蛋白质沉淀干燥，沉淀粉末用3% SDS重新溶解，测定其蛋白质质量浓度。同时处理3个平行样本。　　1.3.2  方法2（超声波裂解法）  将细菌沉淀于37 ℃水浴中孵育30 min，加1 mL裂解液，其余同方法1。　　1.3.3  方法3（热裂解法）  将细菌沉淀于37 ℃水浴 　 中孵育30 min，加入1 mL裂解液，混匀后100 ℃沸水浴15 min，然后取10 μL混悬液涂片进行革兰染色，其余步骤同方法1。　　1.3.4  方法4（热裂解超声法）  细菌沉淀于37 ℃水浴中孵育30 min，加1 mL裂解液，混匀后100 ℃沸水浴15 min，冷却至4 ℃后超声，其余操作同方法1。　　1.4  细菌裂解程度观察 　　取菌悬液涂片进行革兰染色，100倍油镜观察并采集图像。　　1.5  SDS-PAGE检测 　　按《蛋白质技术手册》[7]操作，浓缩胶5％，分离胶12％。浓缩胶80 V电泳30 min，分离胶120 V电泳90 min。考马斯亮蓝G-250染色，脱色至背景清晰。每个样本复3孔，电泳及染色重复3次。凝胶成像分析系统观察并采集图像。　　1.6  蛋白质质量浓度测定 　　采用RC DC蛋白定量法和BCA蛋白定量法，按试剂盒说明操作。RC DC法可直接测定裂解上清液中蛋白质质量浓度。测定时每个样本设3个平行管，同时制作标准曲线（质量浓度范围为0~1.5 g/L）。BCA法测定3%SDS溶液蛋白质质量浓度。测定采用微板法，每个样本设3个平行孔，同时制作标准曲线（质量浓度范围为0~2 g/L）。　　1.7  统计分析　　采用SPSS 11.5统计软件包对数据进行处理，对不同方法提取的蛋白质质量浓度进行单因素方差分析。2  结果 　 2.1  细菌破碎程度分析　　未经处理的变链菌为G+球菌，呈长链状排列，见图1左。经方法1处理后细菌呈分散状态，在G+菌体周围出现染色阴性的菌体碎片，见图1中。镜下观察，方法2、方法4中细菌的破碎程度与方法1无明显差异。方法3中细菌破碎程度明显低于其他3种方法，见图1右。　　2.2  蛋白质SDS-PAGE图谱　　图2为用方法1提取的3个平行细菌样本的蛋白质电泳图谱，显示3个平行样本及每个样本的3个复孔的蛋白质条带分布基本一致，重复电泳3次的谱图基本相同。　　不同方法提取蛋白质经SDS-PAGE分离后的条带存在差异，见图3。方法3提取的蛋白质条带分布和丰度与其他几种方法有明显差异。其余3种方法提取的蛋白质条带分布基本相同，但条带丰度存在差异，方法1提取的蛋白质条带丰度最高。 extraction methods　　2.3  提取蛋白质质量浓度分析　　RC DC法和BCA法测得蛋白质质量浓度结果见图4。由图4见，其中方法1提取的蛋白质质量浓度最高，其次为方法2，方法3提取的蛋白质质量浓度最低，各方法提取蛋白质质量浓度差异有统计学意义（P<0.05）。对同一样本，BCA法测得的质量浓度低于RC DC法。3  讨论　　变链菌蛋白质组学为龋病的防治研究提供了一个新的途径和平台，其中首要和关键的步骤是细菌蛋白质的提取，采用不同方法提取蛋白质的效果不同[8-10]。细菌需裂解以释放其胞体内及膜上的蛋白质，裂解比例越大，释放的蛋白质越多。细菌裂解后，胞壁破裂，胞内物质溢出，推测其染色特性和形态可能明显改变，因此，本研究以在显微镜下直接观察细菌染色涂片的方法来评价细菌的破碎程度。裂解细菌的方法主要有机械和非机械两类方法，机械法包括高压法[11]、超声波裂解法[12]等；非机械法包括渗透裂解法[13]、酶裂解法[1，5]等。两类方法各有优劣，非机械法中使用的一些降解细胞壁成分的物质如溶菌酶等，将外源性蛋白引入样本，在蛋白质组研究中会影响后期分析[9]；机械法通常裂解条件比较剧烈并耗时，但不会将外源性物质引入样本，有利于蛋白质组研究[4]。一般根据研究目的和欲裂解细菌的特性选择裂解方法。变链菌为G+兼性厌氧球菌，细胞壁难以破碎，因此，一般采用较为剧烈的方法裂解，如超声[1-4]、加入氧化铝粉末混合研磨[7]等。　　本研究结果显示，热裂解法处理的变链菌裂解程度大大低于超声波裂解法，提示在含SDS的裂解液中，简单的煮沸也可以使细菌溶胀破碎，但其效率远远低于超声波。反复冻融法是利用当细胞处于-20 ℃低温环境时，胞内外环境中的水形成冰晶，产生膨胀压，导致细胞机械损伤，同时冻结过程中冰晶的析出致使溶质浓缩，电解质升高、渗透压改变；当细胞置于20 ℃环境时，冰晶的溶解使细胞发生溶胀，最终导致部分胞壁破碎[14]。本实验结果显示在超声基础上辅以加热或反复冻融，并未明显增强细菌的破碎程度，说明超声是使细菌破碎的主要因素。　　细菌破碎后，胞内各种相对分子质量的蛋白质同时溶于提取介质中，因此对其蛋白质构成进行分析，可以评价相同处理条件下提取蛋白质的稳定性和重复性。SDS-PAGE根据相对分子质量对混合蛋白质进行分离，因而可以作为对混合蛋白质中各蛋白构成进行分析的一个有效手段[7]。本实验结果显示，各提取方法均具有较好的重复性，以超声为主的方法提取的蛋白质条带分布基本相同，其中反复冻融超声法提取的蛋白质条带丰度最大，热裂解法提取的最小。提取蛋白质质量浓度从另一个角度反映了细菌裂解的程度和提取介质对蛋白质的溶解能力，可对提取方法进行综合量化评价。有研究发现裂解缓冲液中的某些成分如去污剂、二硫苏糖醇等对分光光度法测定有影响，因而一些常用的蛋白质质量浓度测定方法如Bradford法、BCA法等，难以直接测定这类样本中蛋白质的质量浓度[15]，需经沉淀或透析去除样本中干扰物质后再行测定[10]。沉淀法在去除样本中干扰物质的同时也会造成蛋白质的丢失[15]，因此测定的蛋白质质量浓度大多稍低于样本中实际质量浓度。目前开发出的可以兼容裂解液而直接测定其中蛋白质质量浓度的试剂盒[16]，如RC DC蛋白质定量试剂盒，其测得值更接近样本中蛋白质的实际质量浓度。本研究同时采用BCA法和RC DC法测定各种方法提取的蛋白质质量浓度，结果显示，对于同一样本，采用BCA法测定的蛋白质质量浓度略低于RC DC法，但各方法提取蛋白质质量浓度差异的趋势是一致的。反复冻融超声法提取的蛋白质质量浓度最高，热裂解法提取的蛋白质质量浓度最低。热裂解超声法是超声波裂解法与热裂解法的联合使用，但蛋白定量结果显示2种方法的结合并未使蛋白质的提取率高于超声波裂解法，相反还略有下降，原因可能是煮沸时细菌溶出的蛋白质在后续的超声过程中发生了变性而沉淀，同时细菌量减少也会影响超声破碎效率，使溶于裂解液中的蛋白质质量浓度减少[17]。本研究显示，蛋白定量测定的结果与细菌裂解程度和SDS-PAGE结果一致。　　综合分析细菌破碎程度、提取蛋白质质量浓度及蛋白质SDS-PAGE结果，提示反复冻融超声法可有效提取变链菌蛋白质，具有较好的稳定性和重复性，且操作简单，不需要特殊的仪器。该方法的建立为进一步开展变链菌蛋白质组研究奠定了基础，同时也为类似G+细菌的蛋白质提取提供参考。【参考文献】  [1] Rathsam C, Eaton RE, Simpson CL, et al. 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