药物流出泵基因在白假丝酵母菌生物膜耐药性产生机制中的作用

药物流出泵基因在白假丝酵母菌生物膜耐药性产生机制中的作用作者：亓庆国    作者单位：1.山东大学口腔医院 口腔内科，山东 济南 250012；2.Molecular Microbiology Laboratory, Department of Biology, Northeastern University, Boston MA 02115 USA     【摘要】  　　目的 利用药物流出泵基因缺陷株，初步阐明药物流出泵基因CDR1、CDR2、MDR1在生物膜耐药性产生和表现型耐药菌株产生中的作用。方法 以3种咪唑类抗真菌药物以及CDR1药物流出泵抑制剂作用于药物流出泵基因缺陷株形成的生物膜，采用XTT法和菌落计数的方法，分析药物流出泵基因在生物膜耐药性产生中的作用。结果 药物流出泵基因对缺陷株形成的24 h生物膜SMIC80影响不大，生物膜表现型耐药株的产生与药物流出泵基因有关，抗真菌药物联合CDR1基因抑制剂在一定程度上能够帮助杀灭白假丝酵母菌生物膜耐药株。结论 药物流出泵基因对24 h生物膜表现出来的耐药性影响不大，而对生物膜产生的耐药株有重要作用。     【关键词】  白假丝酵母菌 生物膜 耐药株 药物流出泵 　　Roles of drug efflux pump genes in the mechanism of Saccharomyces albicans biofilm drug tolerance  QI Qing-guo1,2, Micheal. D. Lafleur2. （1. Dept. of Oral Medicine, College of Stomatology，Shandong University，Jinan 250012, China; 2. Molecular Microbiology Laboratory, Department of Biology, Northeastern University, Boston MA 02115, USA）　　 [Abstract]  Objective  Saccharomyces albicans is the main opportunistic pathogen which is also the common member of oral microflora, and the biofilms they formed have spontaneous drug tolerance compared with planktonic ones. Saccharomyces biofilm population can produce subpopulation of cells which can tolerant high concentration of antifungal drugs. They are called persisters. Many researches indicated that drug efflux gene such as CDR or MDR gene plays the very important roles in yeast drug resistance. The objective of this study is to illuminate the mechanism of Saccharomyces albicans biofilm drug tolerance related with drug efflux gene, especially to the persisters formation. Methods  Test the minimal inhibitory concentration（MIC） and SMIC80（sessile minimal inhibitory concentra-tion 80%） of 24 h biofim of totally 7 defective strains of drug efflux pump gene with Amphotercin B. And treat the 24 h biofilm by fluconazole, micronazole, clotrimazole combined with CDR1 inhibitor Enniatin B respectively and antifungal drugs alone as control, then scrapped the biofilm, cultured on the YPD agar. By CFU counting, the numbers of biofilm persisters were determined. Results  All the defective strains have the similar MIC and SMIC80 for 24 h biofilm with wide type strains. CDR1 inhibitor Enniatin B can help antifungal drugs especially micronazole and clotrimazole to eliminate the biofilm persisters. Conclusion  Saccharomyces albicans drug efflux gene may minor associated with 24 h biofilm drug tolerance. Drug efflux gene CDR1 may play an role in persisiters related biofilm drug tolerance. 　 [Key words]  Saccharomyces albicans； biofilm； drug tolerance； drug efflux gene　　白假丝酵母菌（Saccharomyces albicans）也称为白色念珠菌（Candida albicans），是存在于口腔、体表等部位的常驻微生物群，也是人类最重要的条件致病真菌之一[1-2]。生物膜是包括白假丝酵母菌在内的微生物在自然界中的生存方式，其最重要的特征是生物膜微生物具有超强耐药性。2001年有学者[3]在铜绿假单胞菌生物膜中发现耐药菌株，能够耐受较高浓度的药物作用，因其耐药性不具有遗传特性，也被称为表现型耐药菌株。Lafleur等[4]在白假丝酵母菌生物膜中也证实存在表现型耐药菌株。Lewis[5]认为这些菌株可能是生物膜具有耐药性的真正原因，并且与临床上常见的慢性反复性感染有密切关系。研究这些表现型耐药菌株产生的机制，以及如何清除这些菌株具有重要的理论和实践意义。　　以ATP结合盒转运子超家族的主要成分白假丝酵母菌耐药基因1（Saccharomyces albicans drug re-sistance 1，CDR1）和主要易化转运子超家族之一的多药耐药基因1（multidrug resistance 1，MDR1）为代表的白假丝酵母菌药物流出泵，能够将进入细胞内的药物泵出细胞外，从而使真菌细胞产生多药耐药。本课题组[6]的前期工作证实这些基因在生物膜中的确存在一定程度的过表达。缺陷株是研究基因功能的最好工具，本研究将药物流出泵基因抑制剂和抗真菌药物联合应用，作用于药物流出泵基因缺陷株形成的生物膜，初步阐述白假丝酵母菌生物膜耐药性的产生与药物流出泵基因功能的关系。1  材料和方法　　1.1  菌株　　菌株均由美国东北大学生物系分子微生物学实验室提供：YEM30（白假丝酵母菌模式株），DSY448（CDR1基因缺陷株），DSY659CDR1/CDR2基因缺陷株），DSY653（CDR2缺陷株），DSY1050（CDR1/CDR2/MDR1缺陷株），YEM27（CDR1/CDR2/MDR1/FLU1缺陷株），DSY465（MDR1缺陷株）。　　1.2  生物膜的形成及抗真菌药物制备　　所有菌株均从-80 ℃冰箱中取出后，在YPD琼脂培养基上于37 ℃培养24~48 h，取单菌落在YPD液体培养基中30 ℃过夜增菌，离心收集菌株后用灭菌的PBS清洗2遍，用RPMI 1640稀释到每毫升1×106个，作为标准菌悬液备用。　　生物膜的形成过程根据Ramage等[7]的方法制备：96孔细胞培养板每孔加入100 mL标准菌悬液，37 ℃ 摇动培养48 h（100 r/min），然后弃去培养液，灭菌的PBS清洗3次，彻底清除没有黏附的浮游菌株。　　抗真菌药物：氟康唑（fluconazole）（Sigma公司，美国），咪康唑（miconazole）和克霉唑（clotrimazole）（MP公司，美国），CDR1抑制剂Enniatin B（Alexis公司，美国），两性霉素B（Fisher公司，美国），以上药物均由DMSO制备成储存液备用。　　1.3  最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）与抑制附着状态微生物80%活性的最低药物浓度（sessile minimal inhibitory concentration 80%，SMIC80）的检测    根据NCCLS-27A的微量稀释法进行MIC的测定，过程如下：将标准菌悬液稀释为每毫升1×103个，96孔细胞培养板每孔内加入100 μL菌液和2倍梯度稀释的两性霉素B 100 μL（100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78、0.39、0.195、0.097 5 μg/mL），放置于37 ℃培养箱中，24~48 h后读取MIC值。　　使用XTT减低法来测定SMIC80[7]，过程如下：XTT（Sigma 公司，美国）用灭菌的PBS（pH=7.4）溶解为0.5 g/L的储存液放于-80 ℃内备用；Menadione（Sigma公司，美国）用丙酮溶解为10 mmol/L溶液备用；使用前将Menadione加入XTT溶液中，终浓度为1 μmol/L。96孔板中形成生物膜，每孔加入100 μL XTT/menadione，37 ℃避光培养2 h后，分光光度计在490 nm处检测，与对照组相比，使生物膜活性减少80%的药物浓度为SMIC80。　　1.4  抗真菌药物与CDR1抑制剂联合应用清除生物膜实验[4]    分别将YEM30、DSY448、DSY653、DSY659、DSY465置于96孔板内形成24 h生物膜后分为以下几组。M+E组：每孔内加入终浓度为100 mmol/L的咪康唑和12 μg/mL Enniatin B 100 μL；M组：仅加入100 mmol/L咪康唑；C+E组：每孔内加入终浓度为100 mmol/L的克霉唑和12 μg/mL Enniatin B 100 μL；C组：仅加入100 mmol/L克霉唑；F+E组：每孔内加入终浓度为100 mmol/L的氟康唑和12 μg/mL Enniatin B 100 μL；F组：仅加入100 mmol/L氟康唑；E组：仅加入12 μg/mL的Enniatin B 100 μL。空白对照组：每孔加入100 μL RPMI 1640。　　以上各组加入药物后在37 °C培养箱内培养48 h后，弃去药物，并使用灭菌PBS清洗3遍后，将底部的生物膜刮除，离心，梯度稀释后接种在YPD琼脂培养基上培养24~48 h，进行菌落计数，计算经过药物冲击后仍生存的耐药菌株数目。以上数据均设3孔平行对照，数据经过SPSS 11.0进行统计学处理。2  结果　　各菌株对两性霉素B的MIC差别不大，YEM30、YEM27、DSY653的MIC为0.39 μg/mL，DSY465、DSY659、DSY1050、DSY448为0.195 μg/mL。两性霉素B作用于各菌株形成24 h生物膜，其SMIC80无明显差别，YEM30的SMIC80为6.25 μg/mL，YEM27、DSY465、DSY1050的SMIC80为3.125~6.25 μg/mL，DSY659、DSY448、DSY653的MIC为6.25~12.5 μg/mL。　　抗真菌药物与CDR1抑制剂联合应用清除24 h生物膜的结果见图1~5。图1显示抗真菌药物与Enniatin B联合应用对模式株YEM30生物膜的杀灭作用，结果提示：3种抗真菌药物分别联合CDR1抑制剂En-niatin B作用于白假丝酵母菌24 h生物膜后，剩余菌株数量与对照组（抗真菌药物单独应用）的差异均有统计学意义（P<0.01）；咪康唑和克霉唑分别与CDR1抑制剂Enniatin B联合使用的剩余菌株数量少于氟康唑与CDR1抑制剂Enniatin B联合使用（P<0.01）。　　图2显示抗真菌药物与Enniatin B联合应用对CDR1/CDR2缺陷株DSY659生物膜的杀灭作用，结果提示：100 μmol/L咪康唑和克霉唑单独使用或分别联合Enniatin B都可以基本清除CDR1/CDR2双敲除缺陷株生物膜（检出的菌落数在检测水平下）；氟康唑单独作用或联合应用则不能清除生物膜。　　图3显示抗真菌药物与Enniatin B联合应用对野生株CDR2缺陷株DSY653生物膜的杀灭作用，结果提示：克霉唑与CDR1抑制剂联合应用基本可以清除CDR2基因的缺陷株（P<0.01）生物膜。图4显示抗真菌药物与Enniatin B联合应用对CDR1缺陷株DSY448生物膜的杀灭作用，结果表明：Enniatin B有助于咪康唑和克霉唑对CDR1缺陷株生物膜的清除作用（P<0.01）；Enniatin B对氟康唑没有辅助作用（P>0.01）。图5显示抗真菌药物与Enniatin B联合应用对MDR1缺陷株DSY465生物膜的杀灭作用，结果提示：抗真菌药物与Enniatin B联合作用于MDR1基因缺陷株生物膜，剩余菌株数目皆低于单独应用（P<0.01）。3  讨论　　本研究使用两性霉素B作为检测菌株MIC和生物膜SMIC80的药物，主要考虑作为杀真菌药物，两性霉素B可以读出准确的MIC和SMIC80，氟康唑等抑菌药物经常出现拖尾现象，咪康唑和克霉唑的MIC过低，可重复性不好，都难以准确读出MIC和SMIC80。　　结果表明，白假丝酵母菌药物流出泵基因的各种缺陷株，对两性霉素B的MIC和反应生物膜耐药性的指标SMIC80没有明显变化，提示药物流出泵对24 h生物膜的耐药性并无太大影响，这与其他研究结果相符。许多研究表明药物流出泵基因被敲除后，早期生物膜对抗真菌药物敏感，而较成熟的生物膜则保持不变[8-9]，可能与生物膜成熟后，胞外基质增多、菌株生长速度减慢以及其他一些未知因素有关。　　本研究发现，CDR1/CDR2双敲除菌株形成的生物膜可以被较高浓度的咪康唑和克霉唑完全清除（幸存的耐药株数量在检测线之下，可以认为全部被杀灭），而参考株YEM30的生物膜则有较大比例的耐药株幸存；抗真菌药物与CDR1抑制剂联合应用都显示较好的杀灭效果（与抗真菌药物单独应用的差别有统计学意义）；当Enniatin B抑制了CDR1基因后，克霉唑对CDR2缺陷株取得了与CDR1/CDR2双敲除缺陷株相似的杀灭效果；在排除了MDR1基因的干扰后（MDR1基因缺陷株），抑制CDR1基因，同样有利于耐药株的杀灭作用。以上结果都证实，至少CDR1基因与耐药株的耐药性有关。　　如果Enniatin B仅仅对CDR1具有抑制作用的话，抗真菌药物与Enniatin B联合应用对CDR1缺陷株的杀灭效果应该与野生株相似。但本课题组其他实验结果表明，联合应用杀灭了更多的CDR1缺陷株产生的耐药株，提高克霉唑浓度到200 μmol/L后，联合Enniatin B可以杀灭所有的CDR1缺陷株耐药株。其可能的原因包括：1）Enniatin B单独也有一定的抗真菌效果，这种协同作用可能仅仅是两种药物的叠加作用；2）CDR1抑制剂Enniatin B可能对CDR2基因或其他耐药性相关基因也有影响，由于CDR1和CDR2基因具有80%以上的同源性，这种作用也是可能的，但目前还没有Enniatin B对CDR2有抑制作用的相关报道[10]。本实验发现无论是联合应用还是单独使用，咪康唑和克霉唑对白假丝酵母菌，特别是对生物膜的杀灭效果都好于氟康唑，可能与菌株对氟康唑耐药性产生FLU1等基因相关[11]。此外咪康唑除作用于咪唑类药物的常规靶点之外，在较高浓度时还能产生反应性氧化分子，杀死真菌细胞。　　目前，人们希望通过研究微生物生物膜的耐药性机制，发现新的直接针对微生物生物膜相关靶点的新型药物，从而控制临床上由生物膜微生物引起的反复难以控制的感染性疾病[12]。耐药株是这一研究方向上的新发现，在体内这些存在于生物膜中的耐药菌株，抵抗药物作用而幸存，当药物浓度降低时再次繁殖形成新的生物膜，导致感染反复发作。如果在使用常规抗真菌药物的同时，辅助以药物流出泵基因抑制剂杀灭耐药菌株，这可能是治疗慢性反复性真菌感染的一条新途径[12]。【参考文献】  [1] Douglas LJ. 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